载脂蛋白E及其模拟肽对细菌感染性疾病诊断和治疗作用及机制研究

发布时间：2019-09-17 07:49

【摘要】：研究目的 1.研究血清及脑脊液(CSF)载脂蛋白E(ApoE)浓度测定对细菌性脓毒血症和细菌性脑膜炎的诊断价值。 2.通过体外细胞培养和动物实验,研究自主设计的ApoE模拟肽(ApoE23)的抗菌作用及其机制,为其作为新型抗菌药物和免疫调节剂的潜在临床应用提供实验依据。研究方法 1.将临床已明确诊断的细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、细菌性脓毒症患儿纳入研究,以非感染患儿为对照。除常规实验室检验指标(外周血白细胞计数、CRP、CSF常规及生化。CSF及血液细菌培养鉴定、CSF肺炎链球菌抗原检测和革兰染色、CSF肠道病毒RNA定量PCR检测)外,采用透射免疫比浊法测定研究对象的CSF及血清ApoE浓度,采用ROC曲线分析确定诊断界值(CUT-OFF),评价ApoE浓度测定对儿童侵袭性细菌感染的诊断价值。 2.自主设计ApoE模拟肽ApoE23序列,采用固相合成法合成,高效液相色谱法(HPLC)纯化,质谱及电喷雾质谱对合成肽纯度、氨基酸残基组成及分子量进行测定,圆二色谱技术结合K3D3软件进行合成肽二级结构分析。通过α螺旋轮法检测其亲水氨基酸残基及疏水氨基酸残基分布特点。 3. ApoE23抗菌活性采用体外杀菌试验。 4.采用体外细胞培养技术、酶联免疫吸附法(ELISA)、及定量PCR法检测ApoE23对LPS诱导的THP-1细胞(人单核细胞株)及人外周血单个核细胞(PBMC)的TNF-a、IL-6、IL-10表达的调节作用。 5.采用B组鼠伤寒沙门菌脓毒血症小鼠模型研究ApoE23静脉注射治疗对脓毒血症小鼠死亡率影响,通过对脓毒血症小鼠脾脏细菌负荷测定、血浆LPS、TNF-a、IL-6测定及对脾脏、肺脏、肝脏及小肠形态或病理切片分析了解ApoE23抗脓毒血症机理。研究结果 1、共有185例患儿入组,其中细菌性脑膜炎患者26例,病毒性脑膜炎患儿32例,细菌性脓毒血症36例,对照组91例,年龄范围为1月～13岁。细菌性脑膜炎患儿脑脊液ApoE浓度与对照组相比明显增高,而病毒性脑膜炎、脓毒血症患儿脑脊液ApoE仅轻微升高。当脑脊液ApoE浓度cut-off值为1.7mg/L,其诊断细菌性脑膜炎的敏感度、特异度、分别为0.85(95%CI,0.71-1)、1(95%CI,0.89-1),诊断价值高于脑脊液WBC计数、脑脊液总蛋白、葡萄糖及氯化物。当血清ApoE浓度cut-off值为42.0mg/L,其诊断细菌性脓毒血症的敏感度、特异度分别为0.80(95%CI,0.64-0.89)、0.93(95%CI,0.88-0.97),诊断价值高于外周血CRP及WBC计数。 2、自主设计的ApoE23二级结构α螺旋比例为21.6%,且为两亲性螺旋,较国外同类肽具有更好的组织细胞穿透性。 3、ApoE23对革兰阴性杆菌有明显抗菌活性,其MIC50值为1～1.25μmol/L,低于国外同类肽(ApoEdp),对泛耐药鲍曼不动杆菌仍具有明显杀菌活性。ApoE23对革兰阳性葡萄球菌的杀菌活性低于革兰阴性杆菌,对肠球菌及对白色念珠无抗菌活性。 4. ApoE23具有显著下调LPS诱导的人PBMC及THP-1细胞TNF-a、IL-6mRNA及蛋白表达作用,下调THP-1IL-10mRNA及蛋白表达作用、下调人PBMCIL-10蛋白表达。 5、106CFU剂量B鼠伤寒沙门菌腹腔注射后24小时内,生理盐水治疗组小鼠死亡率为60%,ApoE23治疗组死亡率为0。ApoE治疗组小鼠体内细菌负荷、血浆TNF-a、1L-6、LPS浓度均低于生理盐水治疗组。ApoE23治疗组小鼠脾脏、肺脏、肝脏及小肠的炎性改变程度明显低于生理盐水治疗组。结论 1、CSF和血清ApoE浓度测定可作为儿童侵袭性细菌感染的快速诊断指标,具有良好的特异性和敏感性。 2、自主设计的ApoE23抗菌谱窄,可抗胞内寄生菌及泛耐药菌,MIC50低,抗菌活性和组织穿透性优于国外同类肽,具有优质抗菌药物特性。 3、ApoE23对LPS诱导的体外培养免疫细胞的应答反应具有调节作用。 4、ApoE23具有的抗菌及免疫调节双重功能,可显著降低脓毒血症小鼠死亡率,是潜在的脓毒血症治疗药物。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.16

【参考文献】