DC疫苗治疗AD转基因鼠及新型MRI示踪剂检测Aβ的研究

发布时间：2019-10-06 16:24

【摘要】：目的：为了避免治疗阿尔茨海默病疫苗AN1792中的由佐剂所导致的脑膜脑炎等严重的副反应,我们用突变型的Aβ42刺激树突状细胞(树突状疫苗)制备阿尔茨海默病疫苗。在充分的评估其安全性和有效性的基础上,进一步了解树突状疫苗治疗阿尔茨海默病转基因鼠的作用机制。方法：PDAPPV7171转基因鼠48只,小鼠经耳朵打孔编号后采用随机数字表法分为PFDM组(接种经PFDMAβ1～42多肽致敏的树突状细胞疫苗,12只)、佐剂组(接种弗氏佐剂免疫的野生型Aβ1～42肽疫苗,为阳性对照组,12只)、DC组(接种未经多肽刺激的树突状细胞,为PFDM阴性对照组,12只)和PBS组(注射磷酸盐缓冲液,为佐剂组阴性对照组,12只)。另选择与PDAPPV7171且有相同遗传背景的健康8周龄C57/B6雌性小鼠50只(用于树突状细胞的培养)。腹腔注射,每组动物均间隔2周接种1次,共免疫3次。完成治疗后,处死动物,获取鼠脑,固定,石蜡包埋,然后以4um厚度连续切片；每隔六张脑切片,用免疫组化学染色的方法,观察小鼠脑组织中Ap蛋白,核激素肝X受体(LXR),三磷酸腺苷结合盒主动转运蛋白1(ABCA1),,膜结合蛋白酪氨酸磷酸酯酶(CD45),晚期糖基化终产物受体(RAGE),β位点APP内切酶(BACE)的表达水平。每张脑片在显微镜下选取5-10个区域,用体视学的方法选取海马区的CA1,CA2,CA3,DG,Rad和皮层区进行半定量统计分析。灰度水平从0(染色强度最密集即黑色)到255(染色强度最轻即白色)不等。所有测量采用“双盲”的方法。结果：(1)Aβ蛋白表达：Aβ蛋白表达PFDM组(0.18±0.035)和阳性对照组(0.29±0.078)中显著减少,两种疫苗之间比较没有显著意义的。DC组和PBS组A β蛋白几乎没有改变。(2)LXR蛋白表达：LXR在PFDM组及DC组分别为0.046±0.0068,0.040±0.0083,明显高于佐剂组(0.010±0.0035)和PBS组(0.012±0.0032)。(3)ABCA1蛋白表达：ABCA1在PFDM组表达最高(9.28±1.04),DC组(4.39±0.60)明显高于佐剂组(1.52±0.56)和PBS组(1.42±0.54)。(4)CD45蛋白表达：在PFDM组表达为0.90±0.12,明显高于佐剂组(0.75±0.14),DC组(0.20±0.055),PBS组(0.20±0.043)。佐剂组与DC组及PBS组相比也是有显著差异,P值均小于0.001。(5)RAGE蛋白表达：佐剂组表达最低(0.59±0.22)与其他三组相比均有显著差异。PFDM组(1.75±0.39)也明显低于DC组(2.02±0.47)与PBS组(4.72±0.47)。(6)BACE蛋白表达PFDM组(1.09±0.32)高于DC组(0.88±0.11)和PBS组(0.89±0.084),而佐剂组(1.08±0.29)高于PBS组(P0.05) 结论：1、该疫苗是通过多因素的作用达到一个新的免疫平衡的方式来减少Aβ的沉积。2、疫苗不发生类似AN1792实验副作用,可能取决于LXR/ABCA1通道。3、树突状细胞本身也在清除Aβ的过程中扮演着阻挡副反应发生的重要角色,且没有副作用。目的：制备一种无毒、特异性和敏感性良好的示踪剂,用以探测脑内沉积的Aβ,使其成为MR影像。方法：用超小型顺磁性氧化铁颗粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)共价聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)和Aβ1-42做成MRI照影剂。选取12-18个月大的AD转基因鼠30只及与其年龄对应的野生型的小鼠(C57B1/6J)12只,分为实验组(注射USPIO-PEG-Aβ1-42转基因鼠,12只),USPUO注射组(注射USPIO转基因鼠,9只),USPIO-Aβ1-42注射组(注射USPIO-Aβ1-42转基因鼠,9只)及与野生型小鼠组(注射USPIO-PEG-Aβ1-42,12只)。所有示踪剂注射剂量为0.2mMol Fe/Kg小鼠体重,通过左侧股静脉用PHD2000注射泵以60ul/min的速度注射小鼠体内,四小时后,在7-T的Micro-MRI下进行活体(in-vivo),持续2小时20min。完成活体扫描后,处死动物,获取鼠脑,PLP固定过夜,转移到DMSO中保存,直到离体(ex-vivo)大脑扫描；MRI每个层面距离是100umm,有利于接下来对MRI图像的处理。在MRI上探测到的Aβ在T2加权像上与病理切片进行比对。随后,用两种不同的方法对MRI图像进行分析。对活体的MRI连续图像进行T2*的测量,对离体的MRI图像行两两比较的统计参数图(statistical parametric mapping, SPM)的体素分析(voxel-based analysis, VBA).最后对脑组织行红颜色标记的Aβ染色和铁染色。另外选取两只转基因鼠通过颈内动脉注射相同剂量的USPIO-PEG-Aβ1-42用来评价注射方式的改变是否影响示踪剂在脑内的沉积。结果：注射了USPIO-PEG-Aβ1-42的转基因鼠与注射了USPIO, USPIO-Aβ1-42的转基因鼠行VBA分析,结果显示在平层区和海马区有着显著差别；在注射了USPIO-PEG-Aβ1-42的转基因鼠与在注射了同样剂量的USPIO-PEG-Aβ1-42的野生型的小鼠相比,也得到了相类似的结果；通过T2*的分析,结果显示出与VBA结果相一致；在双重染色的病理图片上我们能清楚地看到USPIO-PEG-Aβ1-42和脑内的Aβ很好的结合；经USPIO-PEG-Aβ1-42处理的试验组,无论是在活体的或离体鼠脑老年斑在MRI成像质量均很高。结论：示踪剂USPIO-PEG-Aβ1-42可以透过血脑屏障结合转基因鼠脑内Aβ,并能在MRI上清楚地成像。股静脉注射是一种微侵袭的注射方法,便于以后对AD脑内Aβ的探测以进行纵向比较。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R749.16

【共引文献】