生命早期铅暴露在阿尔茨海默病样变进程中的作用及分子机制

发布时间：2019-11-13 03:40

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是最为常见的引起老年痴呆的脑部神经退行性疾病。但迄今为止，病因和发病机制仍不明确，提出了许多假说。其中β淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)级联假说占主导地位，认为Aβ凝集和聚积是AD病理发生、发展的始动因素和中心环节，可能是各种因素导致AD的共同途径。因此围绕Aβ展开对AD发生、发展进程中的各种影响因素及其调节的机制探讨是目前研究的热点。铅是环境中普遍存在的具有神经毒性的重金属。神经系统发育阶段对铅尤为敏感。人群流行病学研究发现慢性职业铅暴露和其他金属接触与阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和精神分裂症等有关。同时，动物实验研究显示发育早期铅暴露是脑内的淀粉样变的危险因素。可见铅可能通过影响Aβ的代谢而导致AD样病变。因此研究运用生命早期铅暴露小鼠模型，探讨早期铅暴露引起的迟发神经毒性效应及铅在AD样变发生进程中的作用，从而为AD的病因及发病机制研究提供科学依据。目的 1建立生命早期铅暴露动物模型，应用水迷宫实验，观察增龄过程中小鼠空间学习记忆能力的变化，从而为判定早期铅暴露对小鼠中枢神经系统损伤提供依据。 2分析生命早期铅暴露对不同月龄小鼠海马组织β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)基因、β-内分泌酶1(β-secreatase-1,BACE1)、早老素-1(Presenilin-1,PS1)的mRNA水平和蛋白表达水平的影响及海马组织中Aβ的含量的变化，探讨铅暴露对淀粉样蛋白生成的影响。 3评估铅暴露对不同月龄小鼠海马组织整体DNA甲基化水平及APP、PS1基因启动子区DNA甲基化状态的影响，分析铅暴露导致AD样病变可能的分子机制，为铅暴露神经毒性分子机制和AD的发病机制提供新的理论依据。材料与方法 1研究对象清洁级成年C57BL/6小鼠90只(雌60只，雄30只)，按雌:雄=2:1合笼饲养，以获得孕鼠。孕鼠单笼饲养，待其分娩后取雄性仔鼠作为研究对象。仔鼠随机分为4组，每组80只，分别是生长发育期铅暴露组(DP组)：孕鼠饮0.2%醋酸铅水染毒后经母乳给仔鼠染毒直至断乳（21d）。成年期铅暴露组(AP组)：仔鼠第6月龄开始饮0.2%醋酸铅水3个月。生长期和成年期共同暴露组(DAP组)：孕鼠饮0.2%醋酸铅水染毒后经母乳给仔鼠染毒直至断乳（21d）后，再至其第6月龄开始饮0.2%醋酸铅水3个月。对照组(C组)：给予无铅去离子水。 2方法 2.1采用石墨炉原子吸收光谱法测定小鼠血液、海马组织铅的含量。 2.2采用Morris水迷宫实验测定1月龄、6月龄、12月龄、18月龄小鼠空间学习记忆能力。 2.4采用Real-time PCR、Western blot技术分别检测1月龄、6月龄、12月龄、18月龄小鼠海马组织中APP、PS1、BACE1的mRNA水平和蛋白表达水平。 2.3采用Elisa法检测1月龄、6月龄、12月龄、18月龄小鼠海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。 2.5采用高效液相法检测铅暴露小鼠海马组织中基因组DNA甲基化水平。 2.6采用MS-PCR技术检测小鼠海马组织APP基因、PS1基因启动子区DNA甲基化状态。 3统计学分析使用SPSS21.0统计软件包进行统计分析；数据以均数士标准差表示，Morris水迷宫中的逃避潜伏期用重复测量数据方差分析，其余变量用单因素方差分析，当多组样本均数间总体方差分析有差异时，组间两两比较用LSD法分析组间差异。相关性采用Pearson相关分析，检验水准为a=0.05。结果 1生命早期铅暴露对小鼠学习记忆能力影响 1.1血铅和海马铅含量测定结果显示，1月龄和6月龄时，DP组和DAP组血铅和海马铅水平均高于对照组，差异均有统计学意义(均P0.05)；12月龄和18月龄时，AP组和DAP组染毒结束，血铅和海马铅水平增高，DP组、AP组和DAP组与C组相比，，差异均有统计学意义(均P0.05)。 1.2水迷宫实验结果显示，1月龄和6月龄时，DP组和DAP组小鼠第三天至第五天的逃避潜伏期均较C组和AP组长，差异有统计学意义(均P0.05)。12月龄和18月龄时，AP组和DAP组染毒结束，与C组比，铅暴露各组小鼠第三天至第五天的逃避潜伏期差异均有统计学意义(均P 0.05)，DAP组逃避潜伏期最长；铅暴露各组跨越平台次数差异均有统计学意义(均P0.05)。 2生命早期铅暴露对淀粉样蛋白生成的影响 2.1Real-time PCR结果显示APP、BACE1和PS1mRNA表达量在1、6月龄时DP组和DAP组与C组比较，差异均有统计学意义(均P0.05)；在12月龄和18月龄时，DP组、AP组和DAP组均高于C组，差异均有统计学意义(均P0.01)。随着年龄增长， APP、BACE1和PS1mRNA在DP组、AP组和DAP组的表达量均逐渐升高，且差异均有统计学意义(均P0.05)。 2.2Western blot结果显示，APP蛋白、BACE1蛋白和PS1蛋白表达量在12和18月龄时DP组AP组和DAP组均高于C组，差异均有统计学意义(均P0.05)。不同暴露组间APP蛋白、BACE1蛋白两两比较显示，DP组与AP组，DP组与DAP组，AP组与DAP组表达差异均有统计学意义(均P0.05)。PS1蛋白在铅暴露组间两两比较差异无统计学意义(均P＞0.05)。随着年龄增长，DP组、AP组和DAP组的APP、BACE1、PS1蛋白表达量逐渐升高，差异均有统计学意义(均P0.05)。 2.3不同组小鼠海马组织Aβ1-40、Aβ1-42的含量结果显示，1月龄和6月龄时， Aβ1-40、Aβ1-42的含量在各组间差异无统计学意义(均P＞0.05)；在12月龄和18月龄时，DP组、AP组和DAP组与C组比较，差异均有统计学意义(均P0.05)，且随着年龄的增长而呈上升趋势。 3生命早期铅暴露对小鼠海马组织基因组DNA甲基化水平的影响 3.1基因组DNA的甲基化水平比较结果显示，不同组小鼠海马组织基因组DNA的甲基化水平随着年龄的增长而逐渐降低；1月龄和6月龄时，DP组、DAP组与C组比较，差异有统计学意义(均P0.05)；12月龄时，DP组、AP组和DAP组与C组比较，差异有统计学意义(均P0.05)，DNA的甲基化水平分别降低1.2%、1.4%、2.0%；18月龄时，DP组、AP组和DAP组与C组比较，差异有统计学意义(均P0.05)，DNA的甲基化水平分别降低2.0%、1.5%、2.3%。呈低甲基化状态。不同月龄小鼠海马组织APP基因启动子甲基化水平在各组间差异有统计学意义(均P0.05)。铅暴露组组间两两比较，差异均有统计学意义(均P0.01)。不同月龄小鼠海马组织PS1基因启动子甲基化水平在各组间差异有统计学意义(均P0.05)；不同铅暴露组间两两比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)。结论 1生命早期铅暴露可使小鼠血铅和海马铅含量升高，后期排出较慢。 2生命早期铅暴露能够损伤小鼠的学习记忆能力，即便是在去除了铅暴露这个危险因素后也将持续存在学习记忆能力的损害。 3生命早期铅暴露可造成小鼠大脑海马组织中APP过度表达，同时海马组织中BACE1、PS1的表达增高，而导致Aβ生成增多。 4铅暴露可降低小鼠海马组织基因组DNA的甲基化水平；APP基因、PS1基因启动子区呈低甲基化状态。
【图文】：

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C 组 DP 组 AP 组 DAP 组图 2.3 12 月龄小鼠寻找平台的轨迹图2.5.3.1 定位航行实验结果本研究中 1 月龄、6 月龄、12 月龄和 18 月龄小鼠来自 4 个组，但在不同月龄随机选择 10 只进行试验，而不是同一批小鼠，故试验数据分析只考虑 1 月龄、6 月龄、12 月龄、18 月龄小鼠的分组因素和不同训练天数的变化情况。从表 2.3～2.6，用重复测量数据方差分析定位航行试验结果，各时间点之间的关系是否满足 Huynh-Feldt 条件进行球形检验，结果为 P＞0.05，说明重复测量数据之间不存在相关性，满足 Huynh-Feldt 条件，可用重复测量数据的单变量方差分析处理资料，1 月龄时分组因素分析，各组 5d 内的逃避潜伏期差异有统计学意义(F=14.782，P=0.001)，相同时间点组间两两比较显示从第三天开始直至第五天，铅暴露组小鼠逃避潜伏期高于 C 组，差异有统计学意义。6 月龄时各组 5d 内的逃避潜伏期差异有统计学意义 (F=17.982，P=0.002)，同一月龄小鼠，组间两两比较结果显示从第 3 天开始直至第 5 天，铅暴露组小鼠逃避潜伏期高于 C 组，

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注：经ANOVA，与同一月龄对照组比较，*P<0.05，铅暴露组内，与DP 组比图 2.4 不同组各月龄小鼠穿越平台位置的次数变化趋势2.5.4 体内铅含量和学习记忆能力之间的关系由表 2.8 可见各月龄小鼠水迷宫逃避潜伏期与血铅和海马铅呈正越平台位置的次数呈负相关。表 2.7 小鼠血铅和海马铅与空间学习记忆能力指标之间的相关性分血铅含量海马组织铅r P r 逃避潜伏期 0.603 0.001 0.715 1 月龄穿越平台次数 -0.654 0.011 -0.654 逃避潜伏期 0.675 0.012 0.723 6 月龄穿越平台次数 -0.503 0.018 -0.772 逃避潜伏期 0.660 0.001 0.675
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16

【参考文献】