Cdk2抑制剂保护人诱导性多潜能干细胞来源的神经元对抗Aβ毒性

发布时间：2020-01-31 09:56

【摘要】：目的建立阿尔茨海默病(AD)体外疾病模型,筛选小分子化合物及研究相关药物靶点的作用机制。方法通过应用β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)对人诱导性多潜能干细胞(hi PSCs)来源的神经元的毒性作用来模拟AD,并应用该模型进行药物筛选;通过检测细胞活力,细胞免疫荧光,蛋白免疫印记及实时定量PCR等方法研究Aβ1-42毒性作用机制及和相关治疗性药物的作用机制。结果1)本研究所采用的商业化神经元(i Cell#174;Neurons)来源于hi PSCs,是高度纯化的神经元,其中Tu J1(+)/Nestin(-)细胞的比例为98.41%;i Cell Neurons具有前脑特性,其中主要为GABA能神经元和谷氨酸能神经元;i Cell Neurons复苏后可以逐渐形成神经网络,并具有电生理活性。2)Aβ1-42对i Cell Neurons具有毒性作用:可降低其细胞活力,抑制神经突的发生,诱导细胞凋亡及最终导致神经元的丢失。3)应用该种细胞毒性模型进行小分子化合物筛选,在354个化合物中发现了几19个可以对抗Aβ1-42毒性作用的小分子,其中有一个为细胞周期素依赖性激酶2(Cdk2)抑制剂;进一步筛选了一系列商业化的针对不同Cdk亚型的Cdk抑制剂,结果表明Cdk2抑制剂的确具有很强的保护神经元对抗Aβ1-42毒性的作用。4)我们发现Aβ1-42的神经毒性作用与细胞周期事件(CCEs)的发生密切相关:Aβ1-42可以诱导i Cell Neurons重新进入细胞周期S期(DNA合成期)并随后发生凋亡;Aβ1-42还可以诱导Cyclin D1,phos-Rb,E2F1,Cyclin A和Cdk2等细胞周期蛋白的表达增加。5)Cdk2小分子抑制剂可以抑制CCEs的发生,例如:Cdk2抑制剂GW8510可以阻止Aβ1-42引起的Cyclin D1和phos-Rb表达的升高。6)应用针对Cdk2小分子抑制剂或sh RNA可以保护i Cell Neurons对抗Aβ1-42毒性作用。7)成功诱导hi PS-C4(另一个hi PS细胞株)分化成前脑神经元,并且这些神经元对Aβ1-42毒性作用敏感。8)与i Cell Neurons中的现象类似,Aβ1-42可以诱导hi PS-C4来源的神经元重新进入细胞周期S期并随后发生凋亡;此外,Aβ1-42还可以诱导Cdk4,Cyclin D1,Cdk2和phos-Rb等细胞周期蛋白在细胞内的位置发生变化。9)Cdk2抑制剂保护hi PS-C4来源的神经元对抗Aβ1-42的毒性作用,包括阻止其细胞活力的下降和神经元的凋亡及丢失。9)在人胚胎干细胞(H9 ES)来源的前脑神经元中再次证实了Aβ1-42的神经毒性作用和Cdk2抑制剂的保护作用。结论本研究第一次展示了Aβ1-42对hi PSCs来源的神经元具有毒性作用,并应用该细胞模型进行了药物筛选;我们发现Aβ1-42毒性与细胞周期事件密切相关,并且Cdk2抑制剂可以保护神经元对抗Aβ1-42的毒性作用;本研究为如何应用hi PSCs建立神经退行性疾病的体外细胞模型及高通量药物筛选平台提供了一个很好的案例。
【图文】：

图 1 iCell Neurons 中神经元比例检测A）神经元标志物：TuJ1，绿色；细胞核染色：Hoechst，蓝色。B) FACS:荧光激活细胞分选技术；Nestin 为神经前体细胞标志物；；标尺，50 微米。Fig.1 Detecting the ratio of neurons in iCell NeuronsA) Neuronal marker: TuJ1, green; Nuclei staining: Hoechst, blue. B) FACS: fluorescence

图 2 iCell Neurons 内脑区域和神经功能标志物的表达和 B）用 MAP2（绿色），GABA（红色），，vGAT（绿色）和 vGLUT2（红色）标 14 天的 iCell Neurons；用 Hoechst（蓝色）标记细胞核；标尺，50 微米。C）复苏天神经元的实时定量 PCR 结果。
【学位授予单位】：哈尔滨医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R749.16

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本文编号：2575003