腺苷酸环化酶激活剂诱导脆性X智力低下一号基因重新表达的研究

发布时间：2020-04-02 05:35

【摘要】：研究背景：脆性X综合征[fragileⅩsyndrome, Fra (Ⅹ)]是最常见的遗传性智力低下性疾病之一。据保守估计,我国至少有20万脆性X病人,由于病人寿命正常,而智力低下,没有独立生活的能力,因此对家庭和社会造成极大的负担。目前认为Fra(Ⅹ)致病机制主要是脆性x智力低下一号基因(fragileⅩmental retardation-1 gne, FMR1)启动子区内存在(CGG) n三核苷酸重复序列的不稳定扩增及其上游的CpG岛的异常甲基化,这些突变使FMR1基因转录受到抑制,导致其编码产物脆性X智力低下蛋白(fragileⅩmental retardation protein,FMRP)减少或缺如,最终表现为Fra (Ⅹ)。目前认为,CpG岛有无异常甲基化比CGG重复数对表型的影响更为重要。Pietrobono R发现在无DNA甲基化的情况下,CGG重复序列的扩增本身并不阻止FMR1的翻译以及FMRP的产生。已有病例报道,患者FMR1基因(CGG)n已扩增至完全突变,但由于CpG岛未甲基化,FMRP仍能正常表达,所以智力表现正常。从而提示有无甲基化也许是使FMR1基因转录沉默和相应蛋白表达缺如的主要原因。 FMRP的减少或缺如,最终表现为脆性X综合征。FMRP是RNA结合蛋白,可通过转运靶RNA对转录水平的剪切,RNA转运,mRNA稳定及翻译水平起重要调节作用。许多研究都提示FMRP通过对调节mRNA的翻译和蛋白质的合成来影响突触的形成和功能。在树突棘FMRP调节蛋白质的合成,影响突触发育和脑的可塑性。在突触内,若FMRP缺乏,一些蛋白则过度翻译,导致与学习和记忆有关的长时程抑制的增强(LTP)。从而最终引起智力低下和行为问题。另诊断方面也均认为检测FMRP表达率比DNA检测更能反映患者智力低下的水平。总之FMRP的研究对Fra (Ⅹ)的发病机制,临床诊断及治疗的研究至关重要。 Hwu等研究发现,FMR1基因启动子区存在一个具有增强子活性的甲基化敏感区(MSE),与FMR1基因的转录密切相关。该MSE与cAMP反应单位(CRE)碱基序列重叠,而CRE序列是环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(CREB)的结合位点。CREB是一种重要的核转录因子,具有调节包括记忆功能在内的广泛的生物学功能,是长期记忆形成过程所必需的一种普遍存在的调节分子。另研究发现Fra (Ⅹ)患者以及体外模型FMR1基因封闭后细胞内cAMP水平均下降,且FMR1基因(CGG) n三核苷酸片段扩增大小与cAMP含量呈负相关,随着FMR1的编码蛋白——脆性X智力低下蛋白的表达增加,细胞内cAMP的产量明显增加。以上资料提示,FMR1基因、FMRP和cAMP二者之间可能存在相互调控关系。我们前期研究了FMR1基因被甲基化封闭后对cAMP代谢过程中的两个关键酶,即：腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)活性的影响,结果发现FMR1基因封闭后细胞内cAMP水平下降,在FMR1基因封闭组腺苷酸环化酶活性明显降低,而磷酸二酯酶的活性无显著差异。由此,提出FMR1基因的功能缺陷可影响腺苷酸环化酶的活性,腺苷酸环化酶活性抑制可能是影响Fra (Ⅹ)患者细胞内cAMP水平降低的主要原因。假如采用药物提高腺苷酸环化酶的活性,改善FMR1基因细胞内cAMP的低水平状态,是否能诱导沉默FMR1基因转录和蛋白表达呢? 本研究试图在被甲基化封闭的FMR1基因细胞模型的基础上,探讨特异性腺苷酸环化酶(AC)激活剂—弗司可林(forskolin, FSK) (?)秀导沉默FMR1基因转录和蛋白表达的可能性及其效果；并构建FMR1启动子区MSE/CRE荧光素酶报告基因系统,为进一步研究AC激动剂重启FMR1基因的机制,以及AC激动剂活化CRE序列与启动子甲基化的关系奠定基础,可望为该病的治疗提供新的思路和治疗方法。研究方法： 1.细胞培养：K-562及Hela细胞均用RPMI-1640完全培养液加10%的新生牛血清培养,细胞在温度37℃和5%CO2饱和湿度的培养箱中进行传代培养,2-3天更换一次培养基。加硝普钠后的细胞培养均避光培养。 2、制作K-562细胞FMR1基因封闭的细胞模型：采用如下原理制造模型,即：硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)为经典的一氧化氮(nitric oxide, NO)供体,通过可产生的NO活化DNA甲基转移酶(DNA MeTase),使FMR1启动子区CpG岛的MSE中的胞嘧啶发生高度甲基化,从而阻断了核酸因子与启动子的结合,抑制了FMR1 mRNA的转录。 2.1SNP浓度选取：应用普通及Taqman荧光定量PCR观察FMR1基因的封闭效果,据文献分为正常组、SNP500umol/L组、SNP800umol/L组、SNP1000umol/L组(分别加入对应终浓度的SNP),培养24h后收集细胞,据结果选取最佳浓度。 2.2验证SNP在mRNA水平封闭FMR1基因的效果：同上应用两种PCR法观察FMR1基因的封闭效果,分别设6个时间点{12h、24h、48h、72h、96h、96h (72h更换SNP后)}观察一次性加入SNP后封闭持续的时间,及换液后是否有持续封闭效果。 2.3观察SNP对蛋白水平FMRP表达的影响：应用western blot方法,分别取3个时间点(24h、48h、72h)观察FMRP的表达情况。 3、观察腺苷酸环化酶激活剂(FSK)对FMR1封闭基因mRNA水平重启的效果：采用SNP1000umol/L封闭基因,于培养24h后加入FSK(终浓度50μmol/L),分别于12h、24h、48h、72h收集细胞,并设正常对照组,应用上述两种PCR方法观察FMR1基因的封闭后重启效果。 4、观察腺苷酸环化酶激活剂(FSK)重启FMR1封闭基因后对FMRP表达的影响：用western blot方法,于SNP1000umol/L于培养24h后加FSK(终浓度50μmol/L)继续培养至72h之后收集细胞,观察FMRP的表达情况。 5、荧光素酶载体的构建 5.1. FMR1基因启动子区MSE/CRE重叠片段的钓取：按takala质粒提取试剂盒说明书常规提取基因组DNA,用PCR法扩增启动子片段。后将PCR产物与T载体相连,并提取质粒T-MSE,测序验证。 5.2表达载体构建：以T-MSE为模板,应用PCR法获得带有酶切位点kpnⅠ和hindⅢ的野生启动子片段,并提取质粒,之后同PGL-4载体质粒一起用限制性内切酶kpnⅠ和hindⅢ进行酶切,经PCR、双酶切及测序验证后,进行连接构建表达载体。 6、荧光素酶报告基因系统荧光素酶活性检测 6.1细胞转染：将对数生长期的hela细胞以105每孔的浓度铺24孔板,根据Lipofectamine2000转染试剂说明书配置转染混合物(24孔板每孔量)：PGL-4/MSE启动子荧光素酶报告质粒或PGL-4 Basic 5ul+海肾质粒0.5ul+lipo2000 3.5ul,并进行共转,后继续培养。 6.2相对荧光素酶活性检测：收集上述细胞参照Dual-Luciferase Reporter Assay试剂盒说明测定荧光素酶活性。上述实验均相同条件下,重复3次,结果取平均值。 7、统计学分析：所有数据经SPSS13.0统计软件进行统计学处理,除FMRP表达量的数据不符合正态分布采用中位数+极差(M+R)表示外,其他数据均用均数+标准差(X+SD)表示；荧光定量PCR结果的采用2-△△CT值分析,除SNP时间点数据不符合方差齐性组间比较采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallistest,多重比较采用Bonferroni法外,其他均采用完全随机设计多个样本比较的One-Way ANOVA,多重比较采用SLD法；Western blot数据是采用Bia-Rad软件分析得的Density ratio,即A值分析,由于不符正态分布,组间比较采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis test,多重比较采用Bonferroni法；相对荧光素酶活性检测数据应用相对荧光素酶活性强度值分析,组间比较采用两独立样本的t检验；以上均取P0.05表示差异有统计学意义。研究结果： 1、成功制作K-562细胞FMR1基因封闭的细胞模型 1.1 SNP在500、800、1000μmol/L浓度时,均有一定封闭效果(F=105.423,P0.001),其FMR1基因的表达量分别下降到处理前的0.063、0.017、0.006倍,可见SNP1000μmol/L时封闭效果最明显(P0.001),且一次加入封闭效果可持续到96H,于72h换液继续培养后可达持续封闭效果。 1.2 SNP封闭FMR1基因后对蛋白水平FMRP表达的影响：SNP封闭FMR1 24h, 48h,72h后,FMRP的表达量依次下降,提示SNP封闭FMR1基因后可使FMRP的表达明显受抑(H=12.833,P=0.012)。 2、FSK对FMR1封闭基因mRNA水平重启的效果： FSK可于24H时(F=34.921,P0.001；P0.001)重启封闭后的FMR1基因,使其表达量升至对照组的0.133倍,并持续到48H(F=34.921,P0.001; P0.001),此时其表达量是对照组的0.138倍。 3、FSK重启FMR1封闭基因后对FMRP表达的影响：FSK可使表达明显受抑的FMRP重新表达(H=12.833, P=0.012; P=1.00),72h后FMRP的表达量几乎与对照组相当。 4、荧光素酶载体构建：步骤中所有序列(MSE序列、加酶切位点后的MSE序列)测序正确,构建成功的载体经初步鉴定、PCR法、双酶切法及测序验证均成功。 5、荧光素酶报告基因系统荧光素酶活性检测：PGL-4/MSE质粒与海肾质粒共转染hela细胞后,所测得荧光素酶活性强度值分析,与阴性对照组比较,差异有统计学意义,显示质粒成功转入hela细胞。表明以MSE/CRE重叠序列为研究对象的荧光素酶报告基因系统构建成功。研究结论： 1.成功制作了K-562细胞FMR1基因封闭的细胞模型,可使封闭后FMRl基因最低表达量降至处理前的0.006倍,FMRP的表达量降至处理前0.477倍,验证了此方法制造Fra (Ⅹ)细胞模型的可行性。 2.证实FSK可在mRNA水平重启甲基化封闭的FMR1基因,其基因表达量可达对照组的0.138倍,且可持续到48小时；发现用药72小时后FMRP蛋白表达量可接近正常组水平；提示特异性腺苷酸环化酶激活剂可有效地诱导甲基化封闭的FMR1基因转录和蛋白表达,可望为Fra (Ⅹ)的治疗提供新的思路和治疗前景。 3.成功构建了MSE/CRE重叠序列/PGL-4双荧光素酶报告基因系统,为进一步研究AC激动剂重启FMR1基因的机制,以及AC激动剂活化CRE序列与启动子甲基化的关系奠定基础。
【图文】：

扩增曲线,琼脂糖电泳,数据表

琼脂糖电泳图、荧光定量扩增曲线图及数据表:l一1不同浓度SNP对人K一562细胞FMRImRNA表达的影响(X+effectdifferenteoneentrationsofSNponFMRImRNAexPression

智力低下,非正态分布,多重比较,蛋白表达

第一章腺普酸环化酶激活剂诱导脆性X智力低下一号基因重新开启及蛋白表达的研究4、WESTERNBLOT图及数据表1一4SNP及FSK对FMRP表达的影响(M+R)Tablel一4TheeffectofSNPandFSKonFMRpexPression(M土R)grOUP正常组SNP24SNP48SNP72FSK72nDensityratio1.009+0.10.7919+0.050.6939+0.060.4750+0.030.9958+0.04平均秩次12.338.005.002.0012.6712.833P0.01233，Jon注:数据非正态分布，故采用Kruskal一wallistest，，多重比较采用Bonferroni法，SNp24、SNP48、SNP72及FSK72组与正常组相比P值非别为(0.001、(0.001、<0.001及1.000
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.94

【参考文献】