ADDLs体外诱导SH-SY5Y细胞自噬的研究

发布时间：2020-04-06 08:36

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的典型病理表现出现之前,“自噬”已经广泛存在。在这一阶段,β淀粉样蛋白(amyloidβ-peptide, Aβ)衍生的可扩散性配体(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)是核心致病因子。但是它与AD“自噬激活”的关系尚未明确。本研究旨在明确ADDLs体外诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬激活的效应,并初步探讨其作用机制。从以下三方面开展工作：1) ADDLs体外对SH-SY5Y自噬的激活作用。参照相关文献制备ADDLs,并对其进行性质鉴定。用免疫印迹(western blot, WB)检测不同剂量和不同作用时间ADDLs诱导自噬激活的标志物(marker)微管相关蛋白-Ⅰ(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达情况；以上实验用cAMP作为自噬诱导的阳性对照。2)研究ADDLs二级结构对SH-SY5Y自噬的激活的影响。制备不同二级结构的ADDLs,利用圆二色谱仪对不同二级结构的ADDLs进行具体数据分析,计算其中α螺旋和β折叠的含量。用WB检测不同二级结构对ADDLs诱导LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的影响；用免疫荧光检测LC3的细胞定位；用Lyso-tracker示踪和吖啶橙染色观察溶酶体激活情况。3)研究ADDLs诱导SH-SY5Y自噬的通路。检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)激活情况,通过检测其底物p-p70、总p70(t-p70)以及p-p70/p70(t-p70)比值,来判断ADDLs诱导自噬的细胞通路。结果发现：1) ADDLs体外诱导SH-SY5Y自噬的激活作用具有时间和剂量依赖性。时间为0 h、12 h、和24 h时,ADDLs诱导LC3表达量依次升高,在作用48 h时,LC3表达量开始下降；剂量为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L时,诱导LC3表达量逐渐增加,当剂量增加到80μmol/L时,LC3表达量开不再增加。2) ADDLs在组装过程中出现二级结构的变化,这种变化可诱导SH-SY5Y细胞的自噬激活,聚合时间为12～24 h时,α螺旋含量下降至4.5%,β折叠的含量增加至13.9%,在此期间内,可以检测到LC3表达量增加,以LC3-Ⅱ增加更明显。免疫荧光结果显示颗粒状“自噬小体”形态特征出现,以聚合24 h的ADDLs样品作用效果为明显,伴随Lyso-tracker阳性标记和吖啶橙着色颗粒的增加。3)在0-24 h范围内,随作用物聚集时间的延长,p-p70水平下降、总p70(t-p70)变化不明显,p-p70/p70(t-p70)比值下降,说明mTOR的活性被抑制,提示ADDLs诱导SH-SY5Y细胞自噬与mTOR途径相关。综上所述,ADDLs的作用时间、剂量和二级结构变化决定了SH-SY5Y细胞的自噬激活,具有LC3-Ⅱ阳性反应,并且与mTOR的抑制有关。本研究为进一步探讨ADDLs在AD“自噬激活”中的作用提供实验基础。
【图文】：

自噬,时间依赖性,诱导时间,缓翼

LC3Bee)。一actin--+{篡麟嚣缓翼篡图3W七 stemblot检测ADDLs诱导自噬的时间依赖性 Fig.3WestemblotofantoPhagyindueedbyADDLsofdi价 entineubationtimesLanel:ADDLs诱导时间为oh;LaneZ:ADDLs诱导时间为12h;Lane3:ADDLs诱导时间为 24h;Lane4:ADDLs诱导时间为48h.

溶酶体,聚合时间

ADDLs的诱导剂量为40协moFL，诱导时间为24h，ADDLs聚合时间为分别为Oh、12h、24h。分别用叮l定橙和切50一traeker对溶酶体进行染色。可以看出溶酶体明显增加(图10，图11，图12，，图13)。在小鼠神经母细胞瘤NZa中进行同样条件的溶酶体检测，结果与在SH一SYSY细胞中的结果一致(图14，图15，图16)。图10切50一tracke:检测溶酶体 Fig.10LysosomesdeeoratingbyLyso一tracker左:ADDLS聚合时间为24h;范!:阴性对照
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.16

【参考文献】