【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以渐进性认知能力损害和记忆功能障碍为主要表现,并且与年龄密切相关的一种常见的中枢神经系统退行性疾病。其两大重要的病理学改变是神经细胞间聚集的大量老年斑(senile plaques,SP)和神经细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)。老年斑主要由淀粉样多肽-b(amyloid-b,Ab)构成,而神经原纤维缠结的核心成分是由异常过度磷酸化的tau构成。目前,由于缺乏早期非侵入性生物标志物,AD尚不能早期确诊。AD患者的视觉功能障碍是普遍存在的,其患者的视网膜和大脑中发现的组织病理学改变也是非常相似的,并且与认知和行为缺陷的严重程度紧密相关,更重要的是眼球中视网膜的改变可以被非侵入性的手段检测到。流行病学的调查研究发现高同型半胱氨酸血症是AD发生发展的一个独立的风险因素。本课题组前期研究发现,通过给大鼠尾静脉注射同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)14天可以造成大鼠出现AD样学习记忆功能障碍以及AD样病理改变,同时给予叶酸及维生素B12后,可以逆转AD样病变并且改善学习记忆功能。在本研究中,给予大鼠尾静脉渐进性地注射Hcy或同时辅饲叶酸和维生素B12进行治疗,以此研究高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,Hhcy)是否引起大鼠眼睛出现AD样病理改变从而探讨眼睛能否作为早期诊断和评价治疗的窗口。主要研究结果如下:第一部分视网膜pS262-tau和DM-PP2A作为高同型半胱氨酸血症诱导阿尔茨海默病的早期标志分子采用健康的成年雄性SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,通过尾静脉注射不同时间的Hcy,同时观察眼球和海马的病理改变,来研究大鼠眼球是否会出现并早于海马的AD样病变。具体的方法和结果如下:一、血液中逐渐升高的Hcy对大鼠记忆和突触功能的影响为了研究逐渐升高的Hcy对大鼠记忆功能的影响,大鼠尾静脉注射Hcy 400μg/kg/day 3、7和14天,结果显示:大鼠血浆中的Hcy水平随着注射时间的延长而升高,并且在注射后14天出现高同型半胱氨酸血症(Hhcy)。然后,通过新物体识别实验来检测大鼠的记忆功能,结果发现大鼠只有在注射Hcy 14天后才会出现记忆功能障碍,同时旷场实验(open field test,OFT)结果显示不同时间点注射Hcy并不会引起大鼠的运动功能障碍以及焦虑行为。进一步检测了Hcy的逐渐升高对突触功能的影响,用抗体syanpsin-1和PSD-95进行Western blotting检测,结果显示注射Hcy 14天后大鼠的突触蛋白出现明显的降低;长时程增强(Long-term potentiation,LTP)检测结果表明注射Hcy 14天后的大鼠才会引起突触可塑性的降低。这些结果说明大鼠只有在尾静脉注射Hcy 14天后才会出现可检测的记忆功能障碍。二、血液中逐渐升高的Hcy对眼球的影响由于视网膜是大脑神经的延续,并且和大脑有着相似的神经传递系统。并且有大量的研究报告显示在AD患者的视网膜中出现了相关的病理改变。为了研究视网膜是否会出现和海马类似的AD样病变,首先通过眼底照相检测了Hcy注射不同时间点后各组大鼠的眼底改变。结果发现各组大鼠视网膜面均光滑平整,无明显出血及渗出,仅在注射14天后视网膜血管出现了血管迂曲及管径狭窄的改变。视网膜的HE(Hematoxylin-eosin,HE)染色结果显示各组的视网膜组织结构层次清晰,厚度无明显差异。但是注射Hcy 14天后,大鼠视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)的神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)出现了空泡化以及核染色质聚集的改变,同时伴有非常明显的RGC数目的减少。虽然内核细胞层(inner nuclear layer,INL)的细胞数目有下降的趋势,但是统计学上却无明显差异。光学相干断层扫描技术(optical coherence tomography,OCT)对各组大鼠的视网膜检测结果显示各组的视网膜结构层次清晰,无异常隆起或渗出,视网膜厚度无明显改变。这些结果显示尾静脉注射Hcy 14天后,随着大鼠血浆内Hcy的水平增加,视网膜会出现血管狭窄迂曲,RGC形态改变以及数目减少这种与AD时海马区相似的神经退行性改变。同时检测了眼球的其他组织(角膜、晶状体),探究其在注射Hcy 14天后是否也会发生相关的AD样病理学改变。ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)检测眼球不同组织(角膜、晶状体和视网膜)中的Ab42的含量,发现注射Hcy 14天后,Ab42的含量仅在视网膜中增高,在角膜和晶状体中并无明显改变。Western blotting检测三种组织中总tau(Tau-5)、去磷酸化tau(Tau-1)和tau蛋白在Ser396位点的磷酸化(PS396),结果显示三种组织中的Tau-5没有明显改变,但是注射Hcy 14天后,只有视网膜中的Tau-1出现明显降低并且tau蛋白在Ser396位点出现过度磷酸化。这些结果提示大鼠体内Hcy的水平增加,并不会影响角膜及晶状体组织,只有视网膜组织会受其影响出现与AD相关的神经退行性病理改变。因此,我们选择视网膜作为AD的早期诊断窗口。三、Hhcy发展过程中视网膜pS262-tau水平升高比Ab早,且早于海马组织的tau病变为了进一步探讨在Hcy诱导的AD模型大鼠中,视网膜中是否出现比海马更早的病变指标,我们首先检测了不同时间点时两种组织的Ab病变。用ELISA检测各组大鼠视网膜中的Ab42的含量,发现Ab42的含量在视网膜和海马中均在注射Hcy 14天后才有明显的增高;用6E10的抗体对视网膜进行免疫组化和免疫荧光染色显示,注射Hcy 7天后,视网膜的GCL和INL中才开始出现阳性着色;而注射Hcy 3天后,海马6E10的免疫组化染色就开始出现阳性着色;Western blotting检测不同注射时间时各组大鼠视网膜的APP、PS1和BACE1含量显示,PS1在注射7后开始升高,而APP和BACE1在注射14天后才有明显增高。用Western blotting检测不同注射时间点各组大鼠视网膜和海马组织的tau蛋白在Ser262、Ser356、Ser396、Ser214、Ser422和Thr212位点的磷酸化(PS262、PS356、PS396、PS214、PS422和PT212),结果显示视网膜的PS262在注射3天后就开始出现明显增高,而海马在注射14天后才出现PS262的增高。余位点在两种组织中没有明显的差异。用PS262的抗体对各组视网膜进行免疫组化和免疫荧光染色显示,与Western blotting检测结果一致,注射Hcy 3天后,视网膜的GCL和INL中就开始出现PS262的增高。而海马的PS262免疫组化染色显示,在注射14天后才出现阳性着色。这些结果说明Hhcy模型中,大鼠视网膜中pS262-tau的增高明显早于海马中的病变,提示pS262-tau可作为一个早期诊断AD的生物学指标。四、Hhcy升高过程中视网膜甲基化和去甲基化PP2Ac的病理改变明显早于海马组织蛋白激酶的激活或者是蛋白磷酸酯酶的抑制是造成Tau蛋白过度磷酸化的直接原因,而在各种激酶和磷酸酯酶中,GSK-3β和PP2A又是与之联系最紧密的。因此,通过Western blotting检测不同注射时间点各组大鼠视网膜和海马组织的GSK-3β、GSK-3β在Ser-9位点的磷酸化(GSK-3β-S9)、PP2Ac、甲基化的PP2Ac(M-PP2Ac)和去甲基化的PP2Ac(DM-PP2Ac)的含量,结果显示视网膜中甲基化的PP2Ac的降低和去甲基化的PP2Ac的升高明显早于海马组织。余蛋白在两种组织中的表达并无明显差异。用去甲基化的PP2Ac的抗体对各组视网膜进行免疫组化和免疫荧光染色显示,与Western blotting检测结果一致,注射Hcy 3天后,视网膜的GCL和INL中就开始出现去甲基化的PP2Ac的增高。而海马的PS262免疫组化染色显示,在注射14天后才出现阳性着色。这些结果说明Hhcy模型中,大鼠视网膜中甲基化的PP2Ac的降低和去甲基化的PP2Ac的升高明显早于海马中的病变,提示甲基化的PP2Ac的降低和去甲基化的PP2Ac的升高也可以作为一个早期诊断AD的生物学指标。结论Hhcy可引起视网膜发生AD相关病变,其中pS262-tau和DM-PP2Ac增高、M-PP2Ac降低可望成为AD早期诊断指标。第二部分视网膜可作为高同型半胱氨酸血症诱导阿尔茨海默病治疗效果评价的潜在窗口通过对成年SD大鼠进行尾静脉注射同型半胱氨酸14天,模拟高同型半胱氨酸血症诱导的AD样病变,同时给予叶酸及维生素B12,探讨能否通过视网膜评价AD治疗的有效性。实验方法和结果如下:一、叶酸和维生素B12对Hhcy诱导的AD模型大鼠视网膜形态的影响为研究能否通过视网膜来评价AD治疗的有效性,我们采用成年SD大鼠,通过尾静脉注射Hcy(400μg/kg/day)14天复制高同型半胱氨酸血症(Hhcy),或同时辅饲叶酸及维生素B12治疗。结果显示,叶酸及维生素B12能够降低血浆中的Hcy含量。同时视网膜眼底照相检查结果显示叶酸及维生素B12也能够逆转Hcy造成的视网膜血管迂曲变窄的病理现象。二、叶酸和维生素B12对视网膜中Ab的影响用ELISA检测各组大鼠视网膜中的Ab42的含量,发现叶酸及维生素B12能够降低Hcy引起的Ab42含量的增高;三组视网膜6E10的免疫组化和免疫荧光染色也得出了同样的结果;Western blotting检测了与Ab生成相关的APP、PS1和BACE1三种蛋白的含量,结果显示补充叶酸及维生素B12能够降低Hcy引起的其含量的增高。这些结果说明了叶酸和维生素B12能够降低视网膜中由Hcy引起的Ab聚集增高。三、叶酸和维生素B12对视网膜中tau蛋白磷酸化的影响用Western blotting检测三组动物视网膜组织中tau蛋白Tau-1、PS262和PS356位点磷酸化水平的改变。结果显示,叶酸及维生素B12能够逆转Hcy所引起的tau蛋白病变,视网膜p S262-tau蛋白的免疫组化和免疫荧光染色结果与上述结果一致。四、叶酸和维生素B12对视网膜中蛋白激酶和磷酸酯酶的影响进一步检测了视网膜中蛋白激酶和磷酸酯酶的变化,用Western blotting检测三组动物视网膜组织中GSK-3β、GSK-3β-S9、PP2Ac、甲基化的PP2Ac和去甲基化的P P2Ac,结果显示叶酸及维生素B12能够恢复Hcy所引起的蛋白激酶和磷酸酯酶的异常改变。视网膜去甲基化的PP2Ac的免疫组化和免疫荧光染色结果与上述结果一致。结论叶酸及维生素B12治疗可逆转Hhcy诱导的大鼠视网膜AD样病变,提示可通过视网膜来评价AD药物治疗的有效性。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16
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本文编号：2617569
