人间充质干细胞来源外泌体对阿尔兹海默病的治疗作用及其机制研究

发布时间：2020-04-21 01:19

【摘要】：背景阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年痴呆最常见的类型,是一种严重损害患者记忆和认知功能的中枢神经系统退行性疾病。根据世界卫生组织2015年公布的流行病学统计数据显示,世界范围内已有超过47,000,000人罹患老年痴呆,并且这一数字预计将在2050年增长至三倍。阿尔兹海默病在世界范围内,给社会造成巨大的健康风险与经济负担,而目前尚无明确有效的根治方法。脑内β淀粉样蛋白(amyloid-β peptide,Aβ)的异常增多与过度沉积是AD的主要病因与病理学特征。Aβ的增多与沉积可以引起中枢系统神经炎症、氧化应激以及神经细胞自噬功能异常等病理学反应。这些病理反应不仅可以提示AD脑内的神经损伤情况,同时还会反向加重Aβ在脑内的增多与沉积。所以,针对AD不同的病理学反应,寻找有效的治疗方法,成为目前亟待解决的问题。许多研究表明,干细胞治疗可能成为治疗AD的有效途径。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)因其来源广泛、低免疫原性和较高的自我修复作用,成为干细胞治疗中的理想选择。在我们团队过去进行的研究中,已经证实人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC)在AD小鼠模型中可以有效减轻Aβ在脑内的异常沉积并且缓解其神经炎症反应。然而,hucMSC在临床应用中,具有运输难度大、难以保持其生物学活性、其作用成分量化困难等局限性,因此,我们需要寻找一种可以模仿hucMSC功能同时规避其局限性的有效“脱细胞”治疗方法。近年来,外泌体作为一个新型细胞外囊泡进入人们视野,由于其携带多种生物学活性物质且具有细胞间交流功能,科学家们预测,外泌体可能会成为理想的“脱细胞”治疗手段。大批研究团队已经证实,人脐带间充质干细胞来源的外泌体(hucMSC-exosomes)由于具有特殊的形态学和功能学特征,因而参与了多种疾病的发生、进程以及临床治疗。HucMSC-exosomes是一种人脐带间充质干细胞分泌的微小膜泡,具有脂质双层膜结构,直径大约为30-150 nm,可以携带和传递人脐带间充质干细胞来源的重要的信号分子,如RNA、细胞因子和蛋白质等。可以与来源于不同组织、器官的细胞形成细胞间信息传递系统,在增殖分化、免疫调节、氧化应激等途径发挥重要作用。在临床应用中,hucMSC-exosomes除具有人脐带间充质干细胞所有优势外,还可以规避其临床应用中的局限性。HucMSC-exosomes易于量化、储存和运输。另外,hucMSC-exosomes被证实可以通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),实现外周循环与中枢神经系统的细胞间信息传递。然而,hucMSC-exosomes是否具有对AD的治疗作用,以及其作用机制仍然未知。它是否可以有效减轻A β在脑内的沉积?是否可以有效缓解AD的神经炎症和氧化应激呢?目的依据上述背景,本研究主要探究:1.对APP/PS1双转基因小鼠进行hucMSC-exosomes尾静脉注射,观察hucMSC-exosomes对小鼠认知功能和脑内A β沉积的改善作用。2.HucMSC-exosomes是否能通过改善神经炎症,从而促进A β的清除,发挥对AD的治疗作用。3.hucMSC-exosomes是否能通过改善氧化应激损伤,从而减少Aβ生成,发挥对AD治疗作用。实验方法1.取足月剖宫产胎儿的脐带组织,分离华通氏胶,培养原代人脐带间充质干细胞,并进行传代扩增。留取第3-5代细胞培养上清,提取hucMSC-exosomes,并进行hucMSC-exosomes的电子显微镜形态学观察、表面标志物CD9和CD63的Western Blot检测。2.为探究hucMSC-exosomes对AD动物模型的治疗作用,将6-7月龄APP/PS1双转基因小鼠分为hucMSC-exosomes注射组和对照组,注射组给予hucMSC-exosomes尾静脉注射(30μg/只),对照组给予同体积对照组溶液(100μl/只),每两星期注射一次,连续注射四次后,采用Morris水迷宫法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠以及野生组C57小鼠学习与记忆水平。硫黄素染色法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内老年斑沉积情况,ELISA法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内可溶性A β水平,Western Blot检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内NEP、IDE、BACE1、AβPP和CTFβ的含量。3.为明确hucMSC-exosomes是否可以缓解AD动物模型中枢系统神经炎症,采用免疫荧光染色法和荧光定量PCR法检测小鼠脑内小胶质细胞激活情况。ELISA法检测小鼠外周血及脑内炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量。4.为进一步探究hucMSC-exosomes是否可以调节小胶质细胞激活,体外培养BV2细胞,并用A β处理形成AD小胶质细胞模型,分为hucMSC-exosomes治疗组和对照组,hucMSC-exosomes治疗组培养基中给予hucMSC-exosomes(30μg/ml)处理24小时,用免疫荧光法和荧光定量PCR检测小胶质细胞激活情况,ELISA检测细胞培养上清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量。5.为明确hucMSC-exosomes是否可以改善AD动物模型得脑内氧化应激损伤,采用还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒检测治疗组和对照组小鼠脑内氧化应激损伤。6.为进一步探究hucMSC-exosomes在体外对神经细胞AD模型氧化应激的改善作用,采用Aβ处理的SH-SY5Y细胞,分为hucMSC-exosomes治疗组、对照组和空白对照组,hucMSC-exosomes治疗组培养基中给予hucMSC-exosomes处理24小时,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,GSH/GSSG、GPX、SOD、MDA检测试剂盒检测三组细胞的氧化应激水平。实验结果1.HucMSC-exosomes尾静脉注射对APP/PS1小鼠的治疗作用1.1在Morris水迷宫实验中,hucMSC-exosomes注射组小鼠相比于对照组,潜伏期缩短,穿越平台次数增多,并且在平台所在象限停留的时间更久。与野生组小鼠相比,hucMSC-exosomes注射组小鼠的潜伏期在第2、3天仍然较长,但第4、5天就表现为无明显统计学差异,而且在记忆测试中,hucMSC-exosomes注射组小鼠穿越平台的次数和在平台象限的停留时间,也与野生组无明显统计学差异。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射改善了AD小鼠的学习能力和记忆功能。1.2我们对AD小鼠的脑冰冻切片进行硫黄素染色,结果显示,相比于对照组,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑皮层区和海马区内老年斑面积有所减少。ELISA法检测两组小鼠脑内可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的水平,相比对照组,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的水平降低。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射减少了 AD小鼠脑内Aβ斑块的沉积,并且降低了可溶性Aβ的水平。2.HucMSC-exosomes可以调节神经炎症,促进Aβ的清除2.1我们采用Western Blot法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内NEP、IDE的含量,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内NEP、IDE含量增多。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射促进了Aβ的降解。2.2我们采用Iba-1免疫荧光染色,检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内海马区和皮层区小胶质细胞数量,结果显示,hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内小胶质细胞总数减少。采用荧光定量PCR法检测M2型小胶质细胞标记物 YM-1、Arg-1、MRC1、FIZZ1 和 CD163 水平,结果显示hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内M2型小胶质细胞明显多于对照组。采用ELISA法检测小鼠外周血及脑组织内炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量,结果显示,hucMSC-exosomes注射组小鼠外周血及脑组织内促炎因子IL-1β、TNF-α含量较对照组减少,抗炎因子IL-10和TGF-β的含量较对照组增加。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射促进了小鼠脑内小胶质细胞替代激活,发挥免疫调节作用,减轻神经炎症。2.3我们使用Aβ25-35 peptide(20μmol/L)刺激BV2细胞,建立体外小胶质细胞AD模型,并将细胞分为hucMSC-exosomes治疗组(30μg/ml,24小时)和对照组,用免疫荧光法检测M2型小胶质细胞表面标志物Ym1,荧光定量PCR检测两组细胞内M2型小胶质细胞表面标志物Arg1和Ym1的含量,结果均显示hucMSC-exosomes治疗组细胞替代激活增多。采用ELISA试剂盒检测两组BV2细胞培养上清内炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的含量,结果显示hucMSC-exosomes治疗组细胞培养上清内促炎因子IL-1β、TNF-α含量较对照组减少,抗炎因子IL-10和TGF-β的含量较对照组增加。以上结果表明hucMSC-exosomes可以促进小胶质细胞替代激活,发挥免疫调节作用。3.HucMSC-exosomes在体内外均可改善AD氧化应激,减少Aβ的生成3.1我们采用Western Blot法检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑内BACE1、AβPP和CTFβ的含量,结果显示hucMSC-exosomes注射组小鼠脑内BACE1含量减少,CTFβ含量降低。以上结果表明,hucMSC-exosomes尾静脉注射减少了Aβ的生成。3.2我们采用还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒检测hucMSC-exosomes注射组和对照组小鼠脑组织内氧化应激水平,结果可见hucMSC-exosomes注射组小鼠脑组织内GSH/GSSG比值、GPX、SOD含量均相对于对照组增加,MDA水平降低。以上结果表明hucMSC-exosomes尾静脉注射减轻了AD小鼠脑内氧化应激损伤。3.3体外CCK-8实验显示hucMSC-exosomes干预可提高SH-SY5Y AD模型的细胞活性,另外GSH/GSSG、GPX、SOD、MDA检测试剂盒检测结果显示,hucMSC-exosomes体外干预可以改善AD神经细胞氧化应激。结论1.HucMSC-exosomes尾静脉注射可以改善AD小鼠认知功能,降低AD小鼠脑内Aβ斑块沉积和可溶性Aβ水平。2.HucMSC-exosomes在体内外均可以改善AD氧化应激损伤,提高细胞活力,降低AD小鼠脑内AβPP分解酶(BACE1)的含量,减少Aβ生成。3.HucMSC-exosomes可以在体内外抑制神经炎症,并且促进小胶质细胞替代激活,发挥抗炎作用,同时提高AD小鼠脑内Aβ水解酶NEP、IDE含量,促进Aβ的降解,从而减少脑内Aβ含量。意义本课题的研究使我们明确了hucMSC-exosomes在改善APP/PS1双转基因小鼠认知功能和Aβ沉积中的作用,并且从神经炎症及氧化应激方面探索了其治疗机制。为进一步探索hucMSC-exosomes在治疗AD中的应用,提供了重要帮助。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

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