早发型家族性阿尔茨海默病患者外周血单个核细胞MicroRNAs表达谱及初步功能分析

发布时间：2020-04-21 05:08

【摘要】：背景与目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是最常见的神经退行性疾病之一,其病理表现为β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的老年斑、tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)以及大量神经元的丢失。AD可分为散发性AD(Sporadic Alzheimer’s Disease,SAD)与家族性AD(Familial Alzheimer’s Disease,FAD),临床上以SAD多见。AD起病隐匿,其发病机制尚未完全明确,尤其是对早期AD了解相对不足。AD可人为划分为无症状临床前阶段及痴呆阶段,目前认为这两个阶段的过渡是一个连续的过程,因此,FAD家系成员是观察AD临床前阶段及AD发展的的理想人群。微小RNA(MicroRNAs,MiRNAs)是大小约为18-25个核苷具有转录后基因调控功能的单链非编码小RNA。MiRNAs与AD被广泛研究,但FAD与miRNAs目前研究较少。本实验用高通量Illumina测序技术,对PSEN1基因p.G378E突变致病的早发型家族性阿尔茨海默病(Early-onset familial Alzheimer disease,EOFAD)患者外周血单个核细胞行miRNAs的表达谱检测,并行靶基因预测及初步功能分析,探讨EOFAD中miRNAs的作用机制,为了解miRNAs在AD中的发病机制以及AD发生、发展的过程提供帮助。方法:选取2名EOFAD患者及2名正常对照者,分别抽取他们4ml外周血,应用淋巴细胞分析液进行单个核细胞分离,提取总RNA,并分离miRNAs。应用高通量Illumina HiSeq 2500测序技术对EOFAD患者和正常对照者的外周血单个核细胞进行miRNAs表达谱检测,并分析筛选出具有差异表达的miRNAs。通过对miRanda数据库和TargetScan数据库的搜索,进行差异表达miRNAs的靶基因预测,分别搜索得出每个数据库预测的靶基因,然后汇总2个数据库的结果得到共同靶基因(mRNAs)。根据GO数据库、KEGG数据库对预测的靶基因进行功能注释,从而筛选出差异基因体现的显著性功能和显著性的通路。结果:EOFAD患者与正常对照者的外周血单个核细胞相比,共有142个差异表达miRNAs,其中90个上调的miRNAs以及52个下调的miRNAs(p0.05,FC1.2或FC0.833)。若以p值0.05,FC2或FC0.5进行差异基因筛选,则有121个差异miRNAs,其中76个上调的miRNAs以及45个下调的miRNAs,其中明显差异表达的有hsa-miR-3614-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-27a-5p等。通过对miRanda数据库和TargetScan数据库进行预测靶基因并汇总结果,共得到768个靶基因。对预测的靶基因行GO分析发现,EOFAD组与NC组上调miRNAs预测的靶基因的前三位显著性GO为:细胞-基底连接、粘着细胞-基质粘附连接;EOFAD组与NC组下调miRNAs预测的靶基因的前五位的显著性GO为:mRNA分解代谢过程、粘着斑、细胞-基质粘附连接、细胞-基底连接、钙粘蛋白结合。另外,靶基因除参与上述功能外,还与信使RNA分解、RNA分解、细胞周期调控、Wnt信号通路等生理过程有关。对预测的靶基因行KEGG分析发现,EOFAD组与NC组上调miRNAs预测的靶基因的前三位显著性通路为癌症中的蛋白多糖通路、细胞衰老通路、前列腺癌通路;EOFAD组与NC组下调miRNAs预测的靶基因的前三位显著性通路为病毒致癌作用通路、癌症中的蛋白多糖通路、甲状腺激素信号通路。另外,靶基因除参与上述信号通路外,还参与神经营养因子信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、Ras信号通路、细胞衰老、细胞周期等通路。结论:高通量测序是一项较为有效的检测EOFAD患者外周血单个核细胞miRNAs表达谱的方法。EOFAD患者与正常人相比,有明显差异表达的miRNAs,其中hsa-miR-3614-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-27a-5p等miRNAs具有明显差异表达,这些miRNAs可能参与信使RNA分解、核糖核酸分解、细胞周期调控等生理过程以及甲状腺激素信号通路、神经营养因子通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路等信号通路参与EOFAD的发病。
【图文】：

外周血单个核细胞,聚类分析

济宁医学院硕士专业学位论文FAD 组与 NC 组差异表达 miRNAs 谱分析2.1 聚类图分析：用差异筛选得到的差异 miRNAs，根据每个 miRNA 在样本分别对 miRNAs 和样本进行聚类分析，，从 miRNA 的聚类结 EOFAD 患者差异表达的 miRNAs 聚为一类，具有相似的表有类似的功能。NC 组差异表达的 miRNAs 聚为一类具有相，可能具有类似的功能。如图 1 所示为 EOFAD 组与 NC 组细胞的差异 miRNAs 聚类图。

外周血单个核细胞,火山

济宁医学院硕士专业学位论文火山图分析示 EOFAD 组和 NC 组差异的整体情况，从差异倍数差异的显著性水平（p-value，P 值）两个方向对 EOF异进行评估。应用火山图进行展示，每个点代表一个基NAs 为 FC ＞1.2 且 p＜ 0.05，用红点表示。下调 miR且 p＜ 0.05，用蓝点表示。无差异表达的 miRNAs 用灰。
【学位授予单位】：济宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

【参考文献】