阿尔茨海默病中microRNA-106b作用机制的研究

发布时间：2020-04-28 02:29

【摘要】：阿尔茨海默病(alzheimer's disease, AD)是以进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性疾病,是导致老年人痴呆的主要原因。据统计：全球约有2千多万AD病人,并正以每年460万人的速度增加。AD严重影响老年人的生活质量,给家庭和社会带来沉重的负担,是各国面临或将要面临的重要卫生和社会经济问题。现有的研究表明,Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD发病过程中起到重要作用,但是令人遗憾的是,以上述几个方面做为靶点的治疗未能取得令人满意的效果。因此,从新的角度研究AD的发病机理及探寻新的治疗方法是非常有必要的。MicroRNAs (miRNAs)是近年来发现的长约18-25nt小调节RNAs,在转录后水平调节基因的表达。miRNA在脑组织中含量丰富,并在神经系统的发育、神经细胞分化及突触的可塑性方面发挥重要作用。目前,越来越多的研究表明miRNAs的功能异常可能参与了AD的发生。研究发现,1niR-107、miR-29a/b、miR-298和miR-328均可通过BACE1调控AD的发生发展。但是,miRNAs在AD中的作用机制的研究仍处于起步阶段。 TGF-βs,包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,是一种多功能的细胞因子家族,拥有非常重要的神经保护和神经营养作用。TGFBR2是一种高亲和力的TGF-β的跨膜受体蛋白,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。TGF-ps与TGFBR2结合,引起TGFBR2与TGFBR1构成异二聚体复合物,引发细胞内受体激活型Smad2和Smad3的磷酸化,磷酸化的Smad2和Smad3通过与协同型Smad4结合,将TGF-β的信号传递到细胞核内,调控靶基因的表达。Smad6和Smad7属于抑制型Smad,其表达与TGF-β信号通路的活性呈负相关。文献报道,TGF-β1在AD病人的脑组织和脑脊液中表达升高,在血浆中表达降低,TGFBR2在AD患者的脑组织中的表达降低。 本课题为了探讨miRNAs在AD发生发展中的作用,以APPswe/PSΔE9双转基因AD模型小鼠研究对象,用miRNAs芯片和荧光定量PCR的方法检测其miRNAs的表达与正常小鼠之间的差别,发现miR-106b在3月龄和6月龄AD模型小鼠中表达升高,9月龄AD模型小鼠中表达降低。通过(?)argetScan、Pictar和miRanda等miRNAs靶基因预测方法对miR-106b的靶基因进行预测,发现TGFBR2 3'UTR与miR-106b之间有2个预测结合位点。在miR-106b稳转细胞中,发现TGFBR2的蛋白表达降低,但其mRNA水平无明显变化；用miR-106b反义寡核苷酸LAN探针来抑制miR-106b的表达,发现抑制miR-106b的表达后,TGFBR2的表达升高,其mRNA水平无明显改变,这一结果提示miR-106b可能作用于TGFBR2。为了证明TGFBR2 3'UTR序列包含miR-106b作用的位点,将TGFBR2 3'UTR序列克隆至萤光素酶报告载体中,并与miR-106b表达载体共转染至293T和CHO细胞中,然后检测萤光素酶的活性,结果表明miR-106b的过表达可以明显抑制抑制萤光素酶的活性；将TGFBR2 3'UTR-萤光素酶报告载体中miR-106b可能的结合位点采用定点突变的方法突变以后,再和miR-106b表达载体共转染至293T细胞和CHO细胞中,结果发现与对照相比,结合位点1突变后,萤光素酶的活性仅发生微弱的变化,结合位点2突变后,荧光素酶的活性仍明显降低,将这两个与miR-106b结合位点都突变后,荧光素酶的活性与仅突变结合位点1相同仅发生微弱变化,两种细胞中的结果一致,这说明miR-106b可以通过与TGFBR2 3'UTR的预测结合位点1直接结合调节TGFBR2蛋白的表达。为了观察miR-106b对神经细胞生长和分化的影响,用维甲酸诱导miR-106b稳转细胞,发现与对照相比miR-106b稳转细胞经维甲酸诱导后出现明显的细胞变圆、贴壁不好、悬浮、崩解等退行性改变。进一步检测Smads蛋白的表达,在miR-106b稳转细胞中,总的Smad2/3的表达没有改变,而活化的pSmad2/3的表达降低；抑制型Smad6/7的表达升高。此外,用Aβ42寡聚体诱导SH-SY5Y细胞,Aβ42寡聚体诱导12h、24h、36h时后,miR-106b的表达升高,Aβ42寡聚体诱导48h时后,miR-106b的表达降低,表明Aβ42寡聚体可以对(?)miR-106b的表达产生影响。上述在体外的实验结果提示Aβ42寡聚体诱导miR-106b表达异常,miR-106b可能通过调控TGFBR2的表达影响Smads蛋白的表达,从而影响TGF-β信号通路的活性引起了细胞的退行性改变。 对AD模型小鼠体内的TGFBR2蛋白的表达进行检测,发现TGFBR2蛋白在AD模型小鼠体内表达降低。此外,为了更好的在体内研究miR-106b的调控作用,成功构建了miR-106b转基因小鼠。用western blot检测TGFBR2蛋白的表达,与同龄对照相比,miR-106b转基因小鼠脑组织TGFBR2蛋白的表达升高。 总之,本课题通过在体外细胞水平及模型小鼠体内证实了TGFBR2是miR-106b一种非常重要的靶基因,miR-106b可能通过调控TGFBR2影响了TGF-β信号通路的活性,从而参与AD的发病,为AD的治疗提供了新的思路。
【图文】：

加工及调控机制。miRNA基因由RNA聚合酶A印ri一miRNA)分子。然后核糖核酸酶Drosha，剪切pri一到细胞浆，由Dicer加工生成成熟的miRNA。成熟的miR复合体结合，然后与mRNA的3’非翻译端结合抑制mRNAs作为基因表达的负性调控因子，通过抑制靶基因mRNA挥作用。在植物中miRNAS通常通过碱基完全匹配引发靶中miRNAS通常通过碱基的不完全匹配抑制靶mRNAS的明一个miRNAs可以同时调控多个靶mRNAs，同时，一个NAS调控，从而实现翻译调控的瞬时特异性脚l。在神经系统中的表达iRNAs在各组织中广泛表达，有的miRNAS仅在某些特定的增高。近年来发现了大量的神经特异性或在神经组织中富集织中均表达的miRNAs称为CNS一特异性的miRNAs，包括

17rePresentedPositivetransgenieIniee.2.RNA质量的鉴定提取的总RNA在0.7%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果见图1一6。从图中我们可以看到285和185条带清晰明亮，55条带较弱，，这说明又NA无明显降解。此外，我们在紫外分光光度计上测定A260/280，其比值均在 1.8~2.0，说明RNA纯度较好。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.16

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本文编号：2642952