Aβ42蛋白二聚体在膜环境中结构、细胞毒性和聚合关键点的探究

发布时间：2020-05-06 07:22

【摘要】：研究目的:阿尔茨海默症是一种常见的中枢神经系统变性病,患者症状主要表现为失忆、认知功能丧失、人格改变及失语症等,严重影响患者的人际交往和工作生活。据相关权威统计,患者人数占全世界65岁以上人口的6%,而阿尔茨海默症的发病率逐年上升且增长幅度也在不断增加。阿尔茨海默症已经成为人类健康的一大危害因素。尽管阿尔茨海默症已经有了几十年的研究历史,但是它的发病机制仍未被阐明。通过解剖发现,患者脑组织内存在大量的由Aβ蛋白高度聚合而成老年斑,因此Aβ蛋白作为阿尔茨海默症的标志物被广泛的研究。近几年来越来越多的证据表明,相比于由Aβ蛋白高度聚合而成的老年斑,分布于细胞膜中可溶性的Aβ蛋白寡聚体具有明显的细胞毒性。因此,细化的研究Aβ寡聚体的结构性质,寡聚体与膜之间的相互作用以及寡聚体的聚合机制对抑制Aβ寡聚体的细胞毒性具有重要的意义。其中Aβ42二聚体作为Aβ蛋白寡聚体最小聚合单位同样也是最小的毒性单位被广泛的研究,阐明Aβ42二聚体的结构特征,与膜的相互作用以及聚合机制将有助于阿尔茨海默的治疗方案的提出。研究方法:由于通过实验观测发现Aβ二聚体的结构是高度可变,无法准确测定二聚体的结构,本文将根据之前对Aβ42二聚体结构分析结果选取结构最稳定的四种聚合形式(2NCB、CNNC、NCNC、NCCN)使用分子动力学模拟对进行Aβ42二聚体的结构特征,与膜的相互作用以及聚合机制进行探究。1.构建体系我们先对由128个DPPC分子组成的细胞膜进行40ns的平衡模拟,选取平衡后的DPPC膜结构作为构建体系的初始膜结构。初始的四种二聚体分别垂直于膜表面竖直插入DPPC膜中,插入的深度与之前实验观测结果一致。Aβ42多肽的N端极性区位于DPPC膜上片层的磷脂层,其上的两个β折叠在膜中的方向是与磷脂层垂直。对插入二聚体的复合体系填充SPC水分子,并且移除位于DPPC膜疏水区域的水分子,然后在体系内加入适量的Na~+和CL~-离子用于平衡体系自身的电荷。2.平衡态分子动力学模拟本次实验所有的分子动力学模拟都是通过软件Gromacs(version of 5.-rc1)进行的,模拟所选用的力场为经过修改,添加了DPPC分子参数的GROMOS96 53A6力场。在正式的模拟之前体系需要先经历两个平衡步骤:NVT和NPT平衡,消除体系中不合理的原子间位置。经历了NVT和NPT平衡后,对四个体系都进行400ns的模拟,在模拟过程中施加在体系内所有原子上的限制力都会被移除。体系内的长程静电相互作用将在周期性边界条件下使用PME方法进行计算。3.伞形取样以二聚体两条链的质心距离为反应坐标,将其中一条链固定,对另一条链沿Y轴方向施加牵引力,牵引速率为0.01 nm/ps,牵引力常数k=1000kJ/mol/nm2,直到二聚体完全分离。在反应路径中每隔0.1nm~0.12nm设置一个窗口,每个体系设置32个窗口,对每个窗口进行10ns平衡模拟。研究结果:1.Aβ42二聚体的结构特点根据组成Aβ多肽的氨基酸性质,Aβ多肽可以被分为两个部分,N端极性区域和C端疏水区域。根据DSSP分析发现,在模拟过程中二聚体2NCB中一共存在五个区域具有高度的β折叠倾向,两个区域位于N端极性区,第一个区域由第2到5位氨基酸组成,第二区域由第11到14位氨基酸组成。另外三个区域位于C端疏水区,第三个区域由第17到22位氨基酸组成,第四个区域由第31到36位氨基酸组成,第五个区域由第39到41位氨基酸组成。与2NCB相比,其他三种二聚体在C端疏水区域同样存在三个高度β折叠倾向的区域,且位置类似。在N端极性区域则有着明显的区别,CNNC、NCNC和NCCN这三种二聚体在2NCB的N端极性区,表现出明显的低β折叠倾向性,相应的无规则卷曲的倾向性增加。2.Aβ42二聚体对膜的影响通过分析嵌入不同二聚体DPPC膜的APL和流动性发现,四种二聚体对膜存在不同程度的破坏作用,这种破坏作用主要可能是由二聚体N端的β折叠引起的,N端β折叠最稳定的2NCB对细胞膜的影响最大。基于研究结果,在四种二聚体之中,二聚体2NCB有着最大的可能性进行进一步的聚合,同时也是潜在的毒性结构。3.Aβ42二聚体分离过程的关键点基于伞形取样的结果对Aβ二聚体的分离过程进行分析发现,四种二聚体具有不同的链间接触面。2NCB的接触面位于极性区,由两条链的E11到H14组成。CNNC、NCNC和NCCN的接触面位于疏水区:CNNC的接触面由两条链的L17到E22组成;NCNC的接触面由第一条链的L17到E22和第二条链的V39到A42接触组成;NCCN的接触面由两条链的V39到A42相互接触组成。另外随着两条多肽链之间距离的增加,四种二聚体多肽之间的氢键分别在两个多肽质心距离为2.7nm(2NCB),3.2nm(CNNC),3.3nm(NCNC)和2.1nm(NCCN)处全部被破坏。四种二聚体最后被破坏的氢键分别是,H14-H14(2NCB),F20-F20(CNNC),A43-F20(NCNC),A43-A43(NCCN)。研究结论:1.模拟过程中四种二聚体可以稳定的存在于DPPC膜之中。通过对比发现,在C端疏水区四种二聚体具有类似的结构,在N端极性区域则有着明显的区别。相比于CNNC、NCNC和NCCN这三种二聚体,2NCB在N端的β折叠更加稳定。2.四种二聚体对膜存在不同程度的破坏作用,破坏作用主要可能是由二聚体N端的β折叠引起的,N端β折叠最稳定的2NCB对细胞膜的影响最大。3.四种二聚体存在不同的聚合接触面,分离路径也不尽相同。通过对比最后断裂的氢键发现His14,Phe20,Ala42是结合关键点。针对这三个位点进行修饰可能对Aβ42二聚体的聚合产生很大的影响。
【图文】：

然后在体系内加入 6 个 Na+离子用于平衡体系自身的电荷。构建完毕的体系如图1.1图 1.1 构建好的四种膜蛋白复合体系，蓝色区域为 N 端亲水区，红色区域是C 端疏水区。使用不同大小和颜色的球体代表水分子（浅蓝色）和磷原子（黄色），DPPC 双层膜的疏水侧链（酰基链）以青色线表示。1.1.3 平衡态分子动力学模拟本次实验所有的分子动力学模拟都是在软件 Gromacs（version of 5.-rc1）上进行，，模拟所选用的力场为经过修改，添加了 DPPC 分子参数的 GROMOS9653A6 力场[64-65]。采用 NVT 和 NPT 两个平衡模拟去除体系中有冲突的原子间作用力。首先进行 NVT 平衡，平衡过程中限制 DPPC 分子和二聚体的运动，体系温度设置为 323K，运用 v-rescale 恒温器限制体系的体积

结果如图1.2。从图中可以看出在整个模拟过程中，四种二聚体在前 100ns 模拟过程中出现了不同程度的结构波动，但在之后 300ns 模拟过程中四种二聚体结构的 RMSD值逐渐收敛，这说明四种二聚体的结构趋于稳定。图 1.2 膜环境中四种二聚体在 400ns 模拟过程 RMSD 值的波动图，黑色为2NCb，红色为 CNNC，蓝色为 NCCN，绿色为 NCNC。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

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本文编号：2650901