纳米微粒载NF-κB圈套基因作用精神分裂症动物模型研究

发布时间：2020-05-09 12:24

【摘要】： 目的： (1)制备纳米微粒基因载体，探讨其结合、保护DNA的优势。 (2)分析精神分裂症模型动物NF-κB介导的细胞因子变化，从免疫学方面探讨精神分裂症的病理机制。 (3)探讨纳米微粒载NF-κB圈套基因作用于精神分裂症模型动物后对NF-κB介导的细胞因子的干预效果。方法： (1)运用乳化聚合法通过单因素试验结合正交分析优化制备条件，制作合适平均粒径PBCA纳米微粒，并对其进行表面改性，制备适合作为纳米微粒基因载体的纳米微粒。 (2)利用纳米微粒作为基因载体结合哑铃型NF-κB圈套基因，制成纳米微粒载NF-κB圈套基因。 (3)利用体重为350±20g雄性wistar大鼠，注射0.3mg／kg、0.6mg／kg、1.2 mg／kg、1.8 mg／kg、2.4 mg／kg不同剂量MK-801，观察实验动物的行为变化，优化模型制作的最佳剂量，建立精神分裂症动物模型。 (4)利用纳米微粒载NF-κB圈套基因通过侧脑室注射抑制NF-κB蛋白活性，考察动物在行为学上的变化，同时考察纳米微粒载圈套基因对TNF-α、ILlp、IL-2、IL-6、IL-10 mRNA表达的影响。数据结果采用SPSS统计软件包处理。结果： (1)单因素试验和正交试验确定制备平均粒径74±3nm纳米微粒(NP)的制备条件：反应溶液pH值为2.5，BCA单体浓度为1％，搅拌速度为1000r／min，表面活性剂为1％的Dextran70，，添加0.3％的Tween-80，在25℃反应3h，调节pH值在6～7之间，继续搅拌1h终止。所制NP为均匀球形，表面平滑完整，粒径分布呈正态分布，分布均匀，跨度仅在0.21左右，分散良好。 (2)采用0.25％CTAB对空白PBCA-NP进行表面改性，Zeta电位从-23.0mV提高到+23mV。MTT法测定细胞毒性，PBCA-NP和CTAB-PBCA-NP均在≤100nng／μl时没有表现出细胞毒性。 (3)经过表面改性的NP在pH值7.0条件下可以质量比10∶1与哑铃型NF-κB圈套基因结合，包封率为96.21％，结合后并未引起NP表面形态和平均粒径的改变。与NP结合以后基因片段抗DNaseⅠ、血清降解，超声破坏的能力得到了显著的提高。 (4)经过剂量实验，注射剂量为0.6mg／kg，注射体积100μl／20g可以诱发较为典型的精神分裂症症状，运动增加、刻板行为明显、存在一定程度的共济失调，社会行为淡漠。同时大鼠仍然保持一定的行为能力未出现中毒症状。 (5)纳米微粒载NF-κB圈套基因在动物实验中以较高的效能抑制了NF-κB的活性，与裸圈套基因相比有显著水平的差异(P=0.0324)。利用纳米微粒载NF-BB圈套基因作用MK-80l模型大鼠，抑制NF-κB的活性，表现出了较好的抑制效应。 (6)纳米微粒载NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠后大鼠的行为发生了显著的变化，MK-801诱导的运动加快、刻板和共济失调行为都低于对照组。其中对运动行为的影响下降了45％，影响达到了极显著水平(P=0.007)；刻板行为方面也达到了显著水平(P=0.046)。共济失调的改善也比较显著，达到显著水平(P=0.026)。 (7)纳米微粒载NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠后NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-10在mRNA水平的表达发生了变化，NF-κB、IL-10表达上调，TNF-α、IL-1β、IL-2表达下调，统计结果均有显著性差异。结论： (1)乳化聚合法工艺可以制备粒径较小、分布均匀的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒。经阳离子表面活性剂CTAB修饰，做为理想的纳米基因载体，携载NF-κB圈套DNA可以较高效能抑制NF-κB的活性； (2) MK-801诱导的精神分裂症模型动物存在NF-κB功能的亢进和多种细胞因子的mRNA的表达的异常； (3)首次将纳米微粒结合基因片段应用于精神分裂症的病理研究，初步结论认为：纳米NF-κB圈套DNA作用于精神分裂症模型动物可以干预NF-κB介导的免疫激活，为研究精神分裂症与免疫系统的关系构建了新的研究平台； (4)应用纳米NF-κB圈套DNA作用于精神分裂症模型动物，可以部分逆转实验动物的诱导症状，证实NF-κB与精神分裂症模型动物的行为存在关联。
【图文】：

表面活性剂,粗度,PH值,分布图

博士学位论文第一部分聚氰基丙烯酸正丁醋纳米粒制备工艺及作为基因载体的本研究中不同表面活性剂及组合均能制得平均粒径在120一130nln的纳(表l一3)，单用PluronieF一68平均粒径最小为121.36士l.36nm，单用Dextra的跨度最小为0.38(图1一l);添加TWeen-80会产生气泡，电镜观察单用TWee制得的NP有粘连，单用Dextran70的表面更加平滑，反应出现乳光即反应的时间也较其它条件快。这是因为Dextran70是阴离子表面活性剂，能加快聚反应的速度，微粒都带负电荷，同性电荷增加了NP的稳定性。因此后续实验用0.5%Dextran70作为单一表面活性剂优化PBCA一NP制备条件。可见表面活剂对PBCA.NP有多方面影响。力忍启月2刀力月42口今礴444，，33

粒度分析,所指,箭头,PH值

PH值为0.5时PBCA.N甲粒径最小;以胶体液出现乳光为准，PH值小于2.0时聚合速度变慢，跨度变大，PH值为0.5时反应时间超过10h;PH值图1一 3pH值为5.0的粒度分析图，箭头所指为大颖粒大于4.0聚合速度变快，平均粒径增大，偶见soonln左右的大颗粒(图1一3)。PH值5.0时制备的PBCA.NP在磁力转子上形成团块，电镜观察有一定的粘连。这是由于PH太小时由于OH一太少、聚合反应太慢，以致无法聚合成球，PH太高时OH.太多，聚合反应太快。因此，在制备PBCA一NP时，严格控制介质的pH值是关键。适宜的pH值下不仅能制得合适大小的NP，另一方面也可以通过改变pH值控制反应速度和聚合程度。 1.3.1.3a-BCA用量对PBCA一NP制备的影响表1一4不同a一B以(%)用量对PBCA一NP粒径和跨度的影响121.m士a咫1加刀士0.用*1刀肠士1.能*l艾67士0.田*1拟屯士0.所*跨度0320.350.30注:与浓度1嚼目比*尸<D.05
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R749.3

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