BDNF修饰骨髓间充质干细胞治疗AD的实验研究

发布时间：2020-05-12 19:16

【摘要】： 研究目的：1.建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、扩增方法；2.探索携带BDNF的高拷贝质粒的构建以及转染骨髓MSCs的方法；3.探讨经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠行为学、海马CA1区组织病理学改变的影响；4.探讨经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响。 研究方法：1.取SD大鼠股骨骨髓,经贴壁筛选法进行体外培养,采用免疫荧光方法鉴定骨髓MSCs表面的抗体CD29,CD44,CD34;2.将pEGFP-BDNF质粒进行改造与pIRESneo相连结,构建携带BDNF的高拷贝质粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用电穿孔技术转染骨髓MSCs,经G418筛选,通过倒置荧光显微镜在蓝色光下激发绿色光判断转染效率,采用Western blot方式判定转染细胞是否表达BDNF蛋白；3.40只健康雄性成年SD大鼠随机分为Sham组,AD组,MSCs组,CON组,BDNF组。采用双侧海马注射Aβ25～35诱导AD大鼠模型,经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs观察对AD大鼠在定位航行试验以及空间探索试验中行为学改变,光镜下海马CA1区HE染色、尼氏体染色的变化以及电镜下海马CA1区神经元及突触超微结构的变化；4.采用RT-PCR及Western blot方式,观察经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响。 结果：1.SD大鼠长骨骨髓经过贴壁培养获得的细胞具有MSCs的表型,并且经过反复贴壁传代获得纯度较高,活性较好的MSCs;2.pIRESneo-EGFP-BDNF经过双酶切鉴定,携带EGFP及BDNF基因,以EGFP基因为报告基因,质粒构建成功：通过电穿孔技术以及G418筛选,明显提高pIRESneo-EGFP-BDNF转染骨髓MSCs的效率；3.Morris水迷宫实验结果提示：AD组与Sham组大鼠比较平均逃避潜伏期(AEL)延长、跨越平台次数明显减少(P0.05或P0.01), MSCs组、CON组、BDNF组与AD组大鼠比较AEL明显缩短、跨越平台次数显著增加(P0.05或P0.01), BDNF组与CON组或MSCs组大鼠比较AEL显著缩短(P0.05或P0.01),跨越平台次数明显增加(P0.05),而MSCs组与CON组比较无统计学意义(P0.05)；病理组织学结果；AD组大鼠海马CA1区神经元细胞数目减少,细胞排列不整齐,细胞器损害较重,突触小泡减少,突触间隙模糊,突触数目减少；MSCs组、CON组、BDNF组SD大鼠海马CA1区锥体细胞带保持较好的完整性,细胞排列较整齐,细胞器超微结构损害较轻,突触小泡及突触数目减少有所减轻,突触间隙比较清楚,以BDNF组改善更为明显；4. RT-PCR结果表明：各组大鼠海马组织中均表达BDNFmRNA、TrkBmRNA, AD组与Sham组比较表达量明显减低(P0.01); MSCs组、CON组、BDNF组BDNFmRNA、TrkBmRNA的表达均较AD组明显提高(P0.01),其中CON组与MSCs组比较无明显差异(P0.01),而BDNF组与CON组或MSCs组比较表达均显著提高(P0.05); Western blot结果表明：各组大鼠海马组织中均表达BDNF蛋白、TrkB蛋白,AD组与Sham组比较表达量明显减低(P0.01); MSCs组、CON组、BDNF组BDNF蛋白、TrkB蛋白的表达均较AD组明显提高(P0.01),其中CON组与MSCs组比较无明显差异(P0.01),而BDNF组与CON组或MSCs组比较均显著提高(P0.05)。 结论：1.通过体外贴壁筛选法扩增培养,获得大量纯度较高、活性较好的骨髓MSCs;2.电转染是很好的基因转染干细胞,提高转染效率的方法,使用电转染方法转染骨髓MSCs可以提高转染效率；3.双侧海马注射Aβ25～35成功诱导AD大鼠模型,方法简单,成功率高；经过侧脑室移植BDNF修饰骨髓MSCs或MSCs可以提高AD大鼠学习记忆能力,减轻大鼠海马CA1区的神经元及突触的损伤,以前者改善更为明显,因此认为BDNF在神经修复中起着重要作用；4.经侧脑室移植BDNF修饰的骨髓MSCs或骨髓MSCs干预AD大鼠模型,可以提高海马区BDNF、TrkB的表达,以前者更为明显,有可能是干预治疗AD的机制之一。
【图文】：

兔疫荧光双染发现，在本实验条件下培养的贴壁细胞具有CD44(图l.4B)的兔疫表型，不具有CD34的免疫表型，符合抗体的特征。所取P3，PS，PS代CD29阳性细胞数分别94D44阳性细胞数分别95%，98%，90%，CD34阳性细胞数分。因此骨髓MSCs贴壁生长方式能得到纯化的细胞，此种培养纯度都比较高，可用于后续实验。大鼠骨髓Mscs经液氮冻存后复苏Mscs经液氮冻存3个月后复苏，种植于25cm，的培养瓶中95%饱和湿度的孵箱培养，24h后更换培养液，弃去未贴壁的液1次，约第6一8天后达到90%的融合，细胞形态较冻存前无冻存后的细胞仍具有良好的增殖能力，可用于实验研究。

PIRESne。载体用EcoRV和Notl进行双酶切，酶切完后产物经回收纯化后，以适合的浓度经 T4DNA连接酶连接，，构建成高效重组表达载体PI既sneo一EGFP一BDNF，载体构建路线图谱见图2.1。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.16

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