M型胆碱能受体活动对前扣带回皮层GABA能中间神经元突触传递的影响

发布时间：2020-05-18 13:56

【摘要】：背景:抑郁症是一种以持续性情绪障碍为主要特征的精神疾病,严重影响着人们的健康生活。尽管近年来神经药理学在精神病学领域取得了进步,但抑郁症的治疗仍然是医学界面临的重大挑战。目前大多数临床抗抑郁药物主要通过对单胺类神经递质系统进行调控发挥作用,但这类药物具有疗效低、起效慢以及具有药物耐受性等缺点。因此,进一步研究抑郁症的病理机制可以为研发新型抗抑郁药物提供重要的靶点和理论支持。前人的研究发现抑郁患者的前扣带回皮层(Anterior Cingulate Cortex,ACC)功能减弱,含生长抑制素(Somatostatin,SST)的γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric Acid,GABA)能中间神经元在ACC脑区表达降低,抗抑郁治疗能够使脑内GABA浓度升高以及GABA受体活动性增强。在抗抑郁药物的研究中也发现,含小清蛋白(Parvalbumin,PV)的GABA能中间神经元也可能介导了抗抑郁作用。这些发现表明,ACC脑区GABA能中间神经元的活动可能是抗抑郁机制研究的一个重要靶点。临床和动物实验研究发现,非选择性M型胆碱能受体(Muscarinic Cholinergic Receptor,m ACh R)拮抗剂—东莨菪碱(Scopolamine,Sco)具有快速且显著的抗抑郁作用,但其具体的作用机制有待进一步明确,进一步揭示其具体的作用机制可以为抗抑郁药物的研发提供重要的理论依据。因此本研究提出的问题是m ACh R活动是否会影响ACC脑区GABA能中间神经元上的突触传递功能?本研究通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术、免疫组化以及膜片钳全细胞记录技术等方法,探讨了激活和拮抗m ACh R活动对ACC脑区GABA能中间神经元突触传递功能的影响,为揭示快速抗抑郁药物Sco的具体作用机制提供理论支持。方法:1、使用SST-Cre和PV-Cre转基因小鼠与Ai9-RFP(Red Fluorescent Protein,RFP)转基因小鼠交配,获得SST-Cre:Ai9-RFP和PV-Cre:Ai9-RFP小鼠。通过免疫组化的方法确定两类小鼠分别在ACC脑区SST中间神经元和PV中间神经元上特异性表达RFP。2、利用膜片钳全细胞(Whole-cell Patch-calmp)记录技术,在SST-Cre:Ai9-RFP和PV-Cre:Ai9-RFP小鼠离体脑片ACC脑区记录表达RFP的神经元电生理特性,包括静息膜电位(Resting Membrane Potential,RMP)、输入阻抗(Input resistance)、动作电位(Action Potential,AP)的阈值(Threshold)、AP中位宽度(Half-width)、AP幅值(Amplitude)、超极化后电位(Afterhyperpolarization,AHP)、放电起始(Initial)和稳定频率(Steady)、放电频率适应性(Spike frequency adaptation),并通过生物素染色观察神经元的形态特征。3、在SST-Cre:Ai9-RFP和PV-Cre:Ai9-RFP小鼠ACC脑区荧光标记的SST和PV中间神经元上,分别记录自发性兴奋性突触后电流(spontaneous Excitatory Postsynaptic Currents,s EPSCs)、微小兴奋性突触后电流(miniature Excitatory Postsynaptic Currents,m EPSCs)、微小抑制性突触后电流(miniature Inhibitory Postsynaptic Currents,m IPSCs),观察m ACh R激动剂Muscarine(10μM)和拮抗剂Sco(100n M)对突触传递的影响。结果:1、免疫组化结果显示,SST-Cre:Ai9-RFP小鼠ACC脑区,表达RFP的神经元中有81%与SST抗体共标;PV-Cre:Ai9-RFP小鼠的ACC脑区的表达RFP的神经元中有83%与PV抗体共标。2、SST-Cre:Ai9-RFP小鼠表达RFP的神经元的电生理特性(n=35):静息膜电位-69.54±0.7m V,输入阻抗319.0±22.69MΩ,AP阈值-35.66±0.97m V、中位宽度0.38±0.02ms、幅值83.36±1.96p A、超极化后电位20.22±0.84m V,起始频率111.4±7.02Hz;稳定频率40.44±3.33Hz,放电频率适应性3.43±0.48;PV-Cre:Ai9-RFP小鼠表达RFP的神经元的电生理特性(n=35):静息膜电位-73.14±0.52m V;输入阻抗180.7±9.68MΩ;AP发生的阈值-27.06±0.81m V;中位宽度0.26±0.01ms、幅值73.31±1.35p A;超极化后电位25.62±0.54m V;起始频率111.9±9.60Hz;稳定频率80.91±5.74Hz;放电频率适应性1.35±0.06。SST-Cre:Ai9-RFP小鼠表达RFP的神经元多呈梭形,具有双极或三极形态;PV-Cre:Ai9-RFP小鼠表达RFP的神经元多呈篮形,且具有多极形态。3、灌流Muscarine激活m ACh R后,ACC脑区SST中间神经元的s EPSCs频率显著增加(p0.01),而幅值变化差异不显著,该作用可以被Sco阻断(p0.01);单独灌流Sco不显著影响s EPSCs和m EPSCs的频率和幅值;Muscarine能够使SST中间神经元m IPSCs的频率显著降低(p0.05)而不显著影响幅值,该作用可以被Sco阻断(p0.05);单独灌流Sco,SST中间神经元m IPSCs的频率显著增加(p0.05)但不影响其幅值。4、灌流Muscarine激活m ACh R后,ACC脑区PV中间神经元的s EPSCs频率显著增加(p0.05),而幅值变化不显著,该作用可以被m ACh R拮抗剂Sco、阻断(p0.05);单独灌流Sco不显著影响s EPSCs和m EPSCs的频率和幅值;灌流Muscarine激活m ACh R对PV中间神经元m IPSCs的频率和幅值的影响均不显著;单独灌流Sco对PV中间神经元m IPSCs的频率和幅值影响不显著。结论:1、结合免疫组化结果、神经元电生理特性和形态特征,基本确定我们记录的ACC脑区表达RFP的神经元为SST中间神经元和PV中间神经元。2、激活m ACh R可以增强ACC脑区SST中间神经元和PV中间神经元的兴奋性突触传递功能,而拮抗m ACh R对SST中间神经元和PV中间神经元兴奋性突触传递功能影响均不显著。3、激活m ACh R可以减弱ACC脑区SST中间神经元的抑制性突触传递,但不影响PV中间神经元的抑制性突触传递;拮抗m ACh R可以增强SST中间神经元的抑制性突触传递功能,但不影响PV中间神经元的抑制性突触传递功能。4、本研究的结果提示,m ACh R活动对ACC脑区SST和PV中间神经元上的突触传递功能有不同的影响。这些不同影响在快速抗抑郁中有何作用亟待进一步的研究。
【图文】：

图 1 本研究实验流程简图2.3 研究意义及创新之处由于现行抗抑郁药物存在各种缺点（疗效低、起效慢、易产生耐受性），而东莨菪碱具有与传统抗抑郁药物不同的快速且显著的抗抑郁作用，进一步明确其具体作用机制，可以为研发新的抗抑郁药物提供一定的理论支持。了解 mAChR 活动对 ACC 脑区 SST 中间神经元和 PV 中间神经元突触传递功能的影响，可以为东莨菪碱的作用机制提供理论依据。以往的研究中对东莨菪碱的作用机制问题大多是在 PFC 上进行的，且没有同时对 SST 中间神经元和 PV 中间神经元进行电生理记录的研究。在研究中，对两类中间神经元的特异性标记很重要。本研究利用 Cre-loxp了系统，获得 ACC 脑区神经元被红色荧光标记的转基因小鼠 SST-Cre：Ai9-RFP和 PV-Cre：Ai9-RFP 小鼠，可以得在离体脑片状态下结合红色荧光准确识别出两类神经元。通过免疫组化、神经元电生理特性及形态特征确认表达 RFP 的神经元属于 SST 中间神经元和 PV 中间神经元。之后使用膜片钳全细胞记录技术，通过

4、结果、结果.1 SST-Cre：Ai9-RFP 小鼠和 PV-Cre：Ai9-RFP 小鼠 ACC 脑区 SST 和V 中间神经元表达 RFP 的特异性如图 2 所示，在荧光显微镜下观察到，在 SST-Cre：Ai9-RFP 小鼠及 PV-Crei9-RFP 小鼠的 ACC 脑区，，广泛表达红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）神经元。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.4

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本文编号：2669825