低剂量铜暴露对WT小鼠和3xTg-AD小鼠海马细胞核蛋白质组的影响

发布时间：2020-05-22 01:22

【摘要】：目的:阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是常见的神经退行性疾病。其最主要的临床表现为认知功能障碍,如记忆能力的渐进性减退等。铜的神经毒性能够加速AD的发生与发展,而细胞核功能紊乱可能是铜导致AD的重要因素之一,但是目前对于铜是怎样影响细胞核功能,加速AD进程尚不清楚。本文旨在利用细胞核蛋白质组学技术,初步确认低剂量铜暴露对WT小鼠和3xTg-AD小鼠海马细胞核蛋白质组的影响,筛选出参与该过程的关键分子。方法:给实验组6月龄野生型(Wild type,WT)小鼠和三转基因AD(3xTg-AD,Tg)小鼠喂养含0.13ppm氯化铜的饮用水,同时以未暴露于铜的3xTg-AD和WT小鼠作为对照组。2个月后,用乙醚对动物进行安乐死处理。首先,采用8-OHdG(8-hydroxyguanosine)免疫荧光、Tunel染色等方法验证铜对WT小鼠和3xTg-AD小鼠神经元损伤情况,采用ATP酶活力检测方法,测定AD小鼠脑组织ATP水平。随之利用荧光差异双向凝胶电泳(two-dimensional fluorescence differencegel electrophoresis,2D-DIGE)结合质谱分析的方法,探究低剂量铜暴露对WT小鼠和3xTg-AD小鼠海马细胞核蛋白质组的影响。最后,使用Western blot和免疫组化试验对差异蛋白进一步验证。结果:免疫荧光实验结果表明,低剂量铜暴露导致3xTg-AD小鼠海马神经元DNA损伤加剧;TUNEL染色结果表明,低剂量铜暴露引起神经元凋亡数量增加。2D-DIGE结合质谱分析结果表明,与WT小鼠相比,在3xTg-AD小鼠海马细胞核中共发现37个差异表达的蛋白;未暴露铜WT小鼠与铜暴露WT小鼠相比,共发现46个差异表达的海马核蛋白;未暴露3xTg-AD小鼠与铜暴露3xTg-AD小鼠相比,共发现43个差异表达的海马核蛋白。生物信息学分析表明,这些差异蛋白主要涉及能量代谢(NDUV1,COX5B,IDH3A,PGAM1,GPDM,KPYM)、突触(complexin-2,synapsin-2,dynamin-1)、DNA损伤和凋亡(PDIA3,PSPC1,PURA)和氧化应激(SODC,PRDX1,PRDX3,PRDX6)等生物过程。进一步的Western blot和免疫组化验证结果表明,与未暴露WT小鼠相比,铜暴露WT小鼠糖酵解相关蛋白PGAM1、三羧酸循环相关蛋白IDH3A、突触相关蛋白synapsin-2、氧化应激相关蛋白SODC及DNA损伤相关蛋白PDIA3的表达均与2D-DIGE结果一致;与未暴露3xTg-AD小鼠相比,铜暴露3xTg-AD小鼠突触相关蛋白synapsin-2和DNA损伤和凋亡相关蛋白PURA、PSPC1的表达与2D-DIGE结果一致。结论:低剂量铜暴露降低AD小鼠脑ATP水平,加剧了3xTg-AD小鼠的DNA损伤及海马神经元凋亡,导致小鼠海马神经元数量显著减少,并通过改变海马组织核蛋白质组,从而影响到AD相关的生理病理过程。数据结果提示,STMN1(stathmin 1)和SODC(superoxide dismutase[Cu-Zn])的变化可作为早期铜神经毒性的潜在生物标志物,铜暴露可能促进了AD的演变过程。
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运输机,细胞内,神经退行性疾病

图 1.1 细胞内铜的运输机制Fig. 1.1 Mechanism of cellular copper transport1.1.2 铜与 AD已知铜与锌、铁一起在调节神经元功能中起关键作用，铜稳态的变化对于几种神经退行性疾病是至关重要的[12]。铜的神经毒性首先在威尔逊氏病（Wilson’sdisease，WD）中被确认，患者 ATP7B 功能受损导致肝、脑和其他组织中铜的过度积累[13-15]。阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，老年斑和神经原纤维缠结是其两个特征性病理学标志[16]。有文献报道，具有催化活性的 Cu（II）通过氧化应激反应中的葡萄糖代谢失调诱导组织损伤来预测和触发 AD[17-19]。此外，，与 AD 相关的一些重要的标志性分子可以与铜结合，如 Aβ，APP，β-分泌酶和 tau 蛋白[20, 21]。研究表明，铜可累积在 AD 患者的海马、基底核、小脑和脑的突触部位，铜过载损害突触可塑性和加速神经退行性过程[22]。流行病学研究也表

技术流程

暨南大学硕士学位论文染料高度匹配的荧光成像仪获取三通道信号，以消除凝胶之间差异，从而检测样品间的蛋白质组表达差异。这里需要样品准备，荧光染料 Cy2、Cy3 和 Cy5 标记蛋白。其中 Cy2 作为内标，Cy3 和 Cy5 的不同荧光强度体现了蛋白表达量的变化；荧光扫描，软件分析差异蛋白表达，结合 MALDI-TOF-MS 质谱鉴定对蛋白进行定量分析。与传统双向电泳相比 2D-DIGE 具备以下优势：灵敏度高、线性范围更广、定量精确。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16

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