阿尔茨海默病细胞损伤的相关机制及加兰他敏的神经保护作用研究

发布时间：2020-05-22 04:13

【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种进行性中枢神经系统退行性疾病。其主要病理变化是脑内胆碱能神经元大量丢失和死亡。研究表明在AD病人脑组织中有大量p淀粉样蛋白(Aβ)沉积。作为细胞存活和功能的重要细胞器,以往研究已经证实线粒体的形态、运动和功能在AD时会受到影响,但关于其运动的长时程连续动态研究尚未见报道。另外,研究也表明AD病人脑内存在胆碱能系统功能异常,而囊泡乙酰胆碱转运体(vesicular acetylcholine transporter, VAChT)是胆碱能神经系统的重要组成部分,已有文献通过免疫组化和放射免疫方法证实AD病人脑内VAChT表达降低,但关于该囊泡的细胞内运动过程及在疾病中的作用的研究较少,且研究手段较单一。根据AD的相关病理变化和发病机制,目前临床上主要采用胆碱酯酶抑制剂治疗AD,加兰他敏就是其中的一种。关于其作用机制,已有研究证实它能够抑制Ap聚集、氧化应激和神经元凋亡等。但是,加兰他敏具体的神经保护机制还没有完全清楚,有待进一步探讨。本论文首先用Ap蛋白活性片段Aβ25-35诱导高分化PCI2细胞凋亡建立AD体外细胞模型,确定20μM Aβ25-35作用24 h为造模的最佳条件。然后在该模型基础上,利用激光共聚焦显微技术、流式细胞术、荧光酶标仪、活细胞工作站、全内反射荧光显微镜(TIRFM)、荧光染料染色、质粒转染、分子生物学技术和计算机图像处理等,对Aβ25-35诱导PC12细胞线粒体运动和功能变化、VAChT运动和蛋白表达变化及加兰他敏的神经保护机制进行了研究。结果发现：(1)Aβ25-35可以诱导PC12细胞线粒体形态运动和功能异常,在Aβ25-35作用早期,线粒体动力学改变是可逆的,依赖于暴露的时间和药物浓度；(2)正常情况下PC12细胞中单个囊泡在膜融合之前的转运,发现VAChT囊泡的运动主要有3种类型,分别为单个囊泡沿一条轨迹长距离运动、多个囊泡沿同一条轨迹运动和单个囊泡沿一条轨迹的双向往返运动,且以第1种运动类型最为常见。在此基础上进一步研究了Aβ25-35对VAChT运动的影响,发现20μM Aβ25-35作用24 h能明显抑制VAChT运动。同时检测到Aβ25-35能显著抑制VAChT蛋白的表达；(3)加兰他敏能抑制Aβ25-35聚集、Aβ25-35诱导的内质网钙释放、内质网应激相关蛋白GADD153和Grp78/94表达上升和下游的caspase-12活化增加。另外加兰他敏也能抑制Aβ25-35诱导的线粒体膜电位崩解、ROS产生、细胞色素c释放、Bcl-2/Bax比值下降和随后的caspase-9活化,最终抑制caspase-3活化,降低细胞凋亡。以上结果提示线粒体和VAChT在AD发生过程中起了重要作用,并且加兰他敏通过线粒体和内质网两条通路发挥了抗凋亡及神经保护作用；为进一步理解AD的病理机制提供了理论基础,也为相关药物研发提供了新的药物靶点。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R749.16

【参考文献】