快速检测阿尔茨海默标志蛋白（Tau）的免疫阻抗生物传感器研究

发布时间：2020-05-27 04:55

【摘要】：20世纪以来,人们对生命的期望急剧上升,在人均寿命逐渐升高的情况下,由阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)引起的老年痴呆约占痴呆老人总数的80%,影响全世界6%的老年人口。病理学已经解释AD的标志蛋白之一为Tau蛋白,而目前Tau蛋白的常规检测方法为ELISA与Western Blot,这两种方法具有检测精度低、检测用时长、仪器昂贵等缺点。近年来,随着电化学传感器的发展,关于蛋白质的电化学研究已渐渐深入。其中,电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectrum,EIS)是分析系统复杂电阻的有效方法,该方法对表面现象和整体性质的变化敏感,且检测不影响蛋白构象,非常适合对微量蛋白质的检测。本文首先对阿尔茨海默症及其标志蛋白Tau做简要介绍,在总结分析常规检测Tau蛋白方法优缺点的基础上,提出使用电化学阻抗法对Tau蛋白进行表征,并通过对EIS技术原理及其目前对蛋白检测的现状进行分析,为构建针对Tau蛋白的自组装传感器打下理论基础。本文基于免疫原理,采用自组装技术制备免疫阻抗传感器。本文试验研究了传感器构建步骤及其参数的优化,成功制备了能够对Tau441蛋白进行特异性检测的自组装免疫阻抗传感器。该传感器通过电化学交流阻抗法进行表征,同时通过循环伏安法进行验证。该免疫传感器具体构建步骤如下:首先对金电极进行打磨,超纯水冲洗后将电极浸入DTSSP溶液,室温过夜,通过巯基-金化学键将DTSSP修饰到金表面。随后在电极表面滴加抗体39E10,室温孵育1h,通过烷磺基-氨基结合抗体,并使用乙醇胺封闭电极表面所有未反应的活性酯基。至此,用来检测Tau441的免疫传感器制备完成。最后将构建好的自组装传感器对Tau441蛋白进行捕获。实验研究结果表明:Tau441蛋白浓度在0.02μg/mL-20μg/mL范围内,Tau蛋白浓度与阻抗值具有线性关系,R~2=0.9888,即相关系数R=0.994,线性方程式为y=3.2702x+9.9758。人血清中含量最高的蛋白为人血清蛋白,因此,实验研究了该免疫传感器结合与Tau441蛋白相同浓度的人血清蛋白,证实自制免疫阻抗传感器对Tau441蛋白具有良好的特异性。为进一步改善该阻抗免疫传感器的性能,提高其灵敏度,试验研究引入Tau441的抗体Tau-12作为二抗,其与Tau441蛋白及39E10(一抗)形成三明治夹心复合物结构,构建免疫夹心传感器,对免疫传感器的信号进行放大。试验研究结果表明:自组装夹心免疫传感器成功对免疫传感器捕获的信号进行放大。当Tau441浓度在0.0002μg/mL-2μg/mL范围内,其浓度对数值与其阻抗之间呈线性关系,线性方程式为y=8.7301x+33.16,R~2=0.9779,即相关系数为0.9888。论文亦试验研究了该传感器在实际检测中应用的可行性。试验配制人工脑脊液,通过模拟人脑脊液环境,用该免疫阻抗传感器对Tau441蛋白进行捕获。结果显示Tau441蛋白浓度在0.0002μg/mL-2μg/mL范围内,其浓度对数值与其对应阻抗具有线性关系,线性方程式为y=1.4471lnx+13.396,相关系数为0.9831。论文构建的自组装传感器对Tau蛋白的检测均在10分钟内结束。综上,论文构建了能够对阿尔茨海默标志蛋白(Tau)进行快速检测的免疫夹心阻抗生物传感器,并试验研究了该免疫传感器在人工脑脊液样本中的应用。研究结果表明:本文构建的夹心免疫阻抗传感器对微量Tau蛋白的捕获具有特异性好、重复率高、检测时间短等优点。本研究为临床上检测早期AD患者脑脊液中的Tau蛋白提供了一种可供选择的方法,对AD疾病早期诊断具有重大的意义。
【图文】：

特征图,阿尔茨海默病,特征图

图 1.1 阿尔茨海默病理特征图[9]样蛋白假说几年，淀粉样蛋白假说是 AD 发病原因的主流假说。由于淀粉样多肽（β-A系统中发生聚集或者自组装成纤维状，导致异常沉淀，产生具有β-折叠的聚集物由于不能被清除而在神经系统内聚集成斑点样斑块。Aβ聚集物与突激发胶质细胞，产生炎症，引发神经信号传递紊乱甚至直接损伤神经元[11白假说，由于针对淀粉样蛋白的药物临床实验失败，以及在 Tau 蛋白研究取得的研究者将目光从 Aβ蛋白转移到 Tau 蛋白[14, 15]。Tau 蛋白是一种具有亲水性微管相关蛋白(microtuble associated protein，MAP)，能保持神经元生长，并细胞内的物质转运。Tau 蛋白的 cDNA 最初从小鼠大脑脑脊液中分离出来尔茨海默病小鼠的脑脊液进行检测，发现其脑中 Tau 蛋白发生过度磷酸化管蛋白，从而影响正常的生理活动[16]。Tau 蛋白稳定的存在于神经元细胞白从微管上解离并形成神经元纤维缠结和成对螺旋丝（paired helical fila

原理图,轴突运输,原理图,过磷酸

杭州电子科技大学硕士学位论文，参与许多生理功能如保持细胞形状、细胞内运输、细胞分裂等。其中理学功能是参与细胞骨架的构成，，正常的 Tau 蛋白作为微管核心部分与微成微管，并维持微管的稳定[29]，另外，Tau 蛋白对维持神经细胞正常形态 Tau 蛋白与细胞骨架蛋白具有相互作用，能够提高 DNA 的复性能力，避的损害[30]。如图 1.2 所示，Tau 蛋白在正常人脑组织中存在一定程度的磷酸和苏氨酸的磷酸化。其中 AD 患者脑脊液中的过磷酸化的 Tau 蛋白含量，这种过磷酸化会导致蛋白脱离微管导致神经元纤维缠结，脱离过程会产正常生理功能的丧失[31]。前文介绍 AD 病变最常见的症状是神经性病变，白的过磷酸化导致错误聚集并形成不溶性的神经网络中的缠结。
【学位授予单位】：杭州电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.16;TP212.3

【参考文献】