氯通道阻断剂对Aβ诱导细胞凋亡的下调作用及其与JNK信号通路的关系

发布时间：2020-05-28 10:05

【摘要】： 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统的退行性疾病,其原因和发病机制至今未明。β淀粉样蛋白(amyloid proteinβ, Aβ)的神经毒作用是导致AD的共同通路,大量研究表明Aβ诱导的细胞凋亡是AD发病的重要病理生理学机制。 细胞膜氯通道的激活可能是介导细胞凋亡的重要离子机制,本实验利用氯通道的阻断剂DIDS和Phloretin研究Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡这一AD模型中氯通道的作用。 JNK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)中重要的通路之一,是参与应激诱导的细胞凋亡的重要信号转导机制,本实验初探Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡过程中是否有JNK蛋白的磷酸化激活,以及氯通道阻断剂DIDS和Phloretin与JNK的磷酸化激活的关系。 由于Aβ诱导神经元凋亡的机制十分复杂,至今尚未找到可以抑制细胞凋亡的关键性靶点。因此,阐明机制找到靶点,将为AD的防治带来希望。 目的: 1.观察氯通道阻断剂DIDS能否抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,了解氯通道在Aβ诱导PC12细胞凋亡过程中的作用。 2.观察对VSOR Cl-通道有相对特异性阻断作用的Phloretin能否抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,从而了解VSOR Cl-通道是否参与下调Aβ毒性作用。 3.探讨JNK在Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡中的作用,以及氯通道阻断剂与JNK的关系。 方法: 1.以传代培养的PC12细胞为研究对象,实验设立阴性组(正常对照组),阳性对照组(仅给Aβ25-35诱导细胞凋亡处理),及实验组(Aβ25-35诱导细胞凋亡+氯通道阻断剂DIDS或Phloretin)。 2.噻唑兰(3-( 4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)比色法观察PC12细胞存活率;用荧光显微镜观察Hoechst33258荧光染色后的细胞核的形态学变化;采用荧光素检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平,反映PC12细胞膜完整性的改变;DNA琼脂糖凝胶电泳,检测PC12细胞凋亡的发生。 3.采用Western Blot印迹法检测Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡时不同时间点P-JNK的表达和不同处理组P-JNK的表达。 4.所有数据应用SPSS11.0统计软件进行数据分析处理。 结果: 1.实验结果验证了Aβ25-35作用于PC12细胞时细胞发生凋亡。并且发现DIDS和Phloretin能够有效地抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。 2. 40μmol/L Aβ25-35作用于PC12细胞(作用24 h)后,MTT实验显示细胞存活率(58.4 %±9.3 %)降低,与阳性对照组相比细胞存活率在Aβ25-35+DIDS组(86.0%±7.2%)或Aβ25-35+ Phloretin组(94.1%±9.3%),均有增加,且差异有统计学意义(P 0.01)。 3. Hoechst33258荧光染色显示Aβ25-35作用于PC12细胞时,细胞出现明显的皱缩,胞核染色质断裂、聚集、固缩等典型的凋亡形态学变化,而实验组凋亡细胞明显减少。 4. LDH释放水平:阴性组与Aβ25-35阳性对照组(433.1±41.5 U/L)比较差异有统计学意义(P 0.01);Aβ25-35阳性对照组与Aβ25-35+Phloretin实验组(354.4±34.3 U/L)比较差异有统计学意义(P 0.01);Aβ25-35阳性对照组与Aβ25-35 +DIDS实验组(366.7±28.3 U/L),比较差异有统计学意义(P 0.01)。 5. DNA琼脂糖凝胶电泳结果:Aβ25-35阳性组可以见到明显的DNA“梯带”,阴性组和实验组没有DNA“梯带”。 6. Western Blot印迹结果:6 h时Aβ25-35诱导PC12 P-JNK蛋白表达量增高,与0 h比较差异有统计学意义(P 0.01)。两个实验组与阳性对照组比较,P-JNK蛋白表达量的差异均有统计学意义(P 0.01)。 结论: 本研究表明:氯通道阻断剂DIDS和Phloretin可以抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,而且,应用氯通道阻断剂可使P-JNK表达降低。因相对特异性的VSOR Cl-通道阻断剂Phloretin可以对Aβ诱导的PC12细胞凋亡起到保护作用,从而推测VSOR Cl-通道在Aβ诱导PC12细胞凋亡时可能被激活。且推测氯通道阻断剂对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的下调作用是通过抑制JNK磷酸化实现的。
【图文】：

图1 MTT比色法检测Phloretin对细胞存活率的影响Fig.1 The effect of Phloretin on cell viability图2 MTT比色法检测DIDS对细胞存活率的影响Fig 2. The effect of DIDS on cell viability

第四军医大学硕士学位论文图3 不同处理组的LDH活力测定Fig.3 The levels of LDH in different groups3.3 Hoechst 33258 染色Hoechst33258 荧光染色显示 Aβ 损伤组 PC12 细胞出现明显的皱缩，胞核染色质断裂、聚集、固缩等典型的凋亡形态学变化；有明显的典型 DNA“梯状”条带等生化改变。Aβ+Ploretin 组和 Aβ+DIDS 组细胞凋亡形态学变化少见。而对照组的细胞则无典型的细胞凋亡的形态学变化。（见图 4）图4 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡(×200，，实心箭头示凋亡细胞)-35-
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R749.161

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本文编号：2685083