神经营养素4与神经保护短肽NAP融合基因克隆及表达的研究

发布时间：2020-06-22 06:55

【摘要】：阿尔茨海默病（AD）和相关的神经系统变性疾病在老年人中的发病率越来越高，甚至被认为是二十一世纪的瘟疫。神经营养因子作为神经保护剂用于治疗中枢神经系统变性疾病已得到了广泛关注，但因其均为大分子蛋白质而难以通过血脑屏障的特点限制了临床应用。近年来小分子肽被认为可能成为它的替代品。活性依赖性神经保护蛋白（activity-dependent neuroprotective protein，ADNP）是一种由血管内皮肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）作用神经胶质细胞后产生的高活性神经营养因子，对多种原因引起的神经元损伤具有神经保护作用。有研究证实ADNP上的一段8肽NAP比ADNP具有更强的神经保护作用以及更低的有效浓度 （10-15Mol）。虽然NAP的分子量小于1000，认为它可以通过血脑屏障（BBB），在AD等中枢神经系统疾病的治疗中拥有广阔的前景。然而NAP的半衰期短，体外人工合成的成本较高等因素限制了其用于慢性神经系统退行性疾病的治疗。为了更好的将NAP用于AD的基因治疗，本研究克隆了神经保护短肽NAP cDNA，将其与神经营养素4（neurotrophin 4，NT4）的信号肽和前导序列相连，构建了NT4与NAP融合基因的原核表达载体pBV220/NT4-NAP，进而成功诱导分泌表达了NAP蛋白。为进一步将NAP用于中枢神经系统变性疾病的基因治疗奠定了基础。 实验方法 一、NAP基因cDNA的制备：采用非对称互补引物/模板法，根据GenBank 提供的NAP基因序列，设计两端含有酶切位点的NAP cDNA的正、负向引物/模板链， 正向引物/模板：5’GCAGCCGGCGTGGCAACGCACCAGTTTC-3’； WP=49 负向引物/模板：5’CGGGATCCCTCGAGTCATTGAGGAATGGAAACTGG-3’。制备两端含有酶切位点的NAP的cDNA。 二、载体的构建策略和步骤：用限制性内切酶Nae I和BamH I联合酶切除去质粒pGEM-T Easy/NT4中NT4的成熟区，将NAP cDNA连接到NT4的信号肽和前导序列的3’端，组成融合基因NT4-NAP，筛选得到含有NT4-NAP基因的克隆。用限制性内切酶EcoR I和BamH I联合酶切，得到融合基因NT4-NAP，并将其亚克隆到原核表达质粒pBV220中。 三、酶切鉴定和DNA测序：限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。融合基因重组于pGEM-T Easy质粒中，筛选得到含有NT4-NAP基因的克隆。采用Sanger 单链末端终止法测出全部的核苷酸序列，比较该序列与GenBank所报道的结果。 四、 生物活性鉴定 经鉴定的重组质粒pBV220/NT4-NAP转染大肠杆菌DH5α, 42℃热诱导表达融合基因，分泌表达NAP蛋白。分离培养8d鸡胚背根神经节(SC-DRG)，培养12h后加入回收的表达蛋白0.1 mL或单纯培养液，继续培养24h，相差倒置显微镜下，观察神经节生长情况。用χ2检验比较两组结果。 实验结果 经DNA测序，限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将NAP重组到NT4信号肽和前导序列的3’端。重组原核表达质粒pBV220/ NT4-NAP构建正确，表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表 达NAP蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出，对照组未见神经突起长出（P0.01）。 研究结果提示 成功克隆的NT4-NAP融合基因，重组于原核表达载体中，重组质粒pBV220/NT4-NAP可分泌表达NAP蛋白，而且分泌表达的NAP WP=50 蛋白有良好的生物活性。本研究为进一步开展NAP基因治疗AD病等中枢神经系统退行性疾病创造了有利条件。 综上所述，神经营养因子一直被认为在治疗中枢神经系统退行性疾病中具有发展潜力，但因其均为大分子蛋白，无法通过血脑屏障，需脑室内注射给药，给临床应用带来了极大困难。NAP是一种由VIP介导神经胶质细胞分泌的神经保护短肽，其对神经系统的保护作用已被大量研究证实。这些研究提示NAP在治疗AD等中枢神经系统退行性疾病中有广阔的发展前景。为了更好的应用NAP治疗AD，本研究采用先进的分子生物学技术，应用非对称互补引物/模板法，根据GenBank提供基因序列克隆了NAP cDNA；由于NAP是活性依赖性神经保护蛋白（ADNP）中一段8肽，缺少分泌表达元件，这给应用基因工程技术在体内或体外分泌表达NAP带来了困难。因此本研究将NAP cDNA的5’端连接到NT4的信号肽和引导肽序列的3’端，构成融合基因NT4-NAP；本研究在原核细胞系统经热诱导表达了融合基因，其结果显示表达的蛋白具有良好的生物学活性，能够促进神经节组织周缘神经突起的生长。这不仅是对NAP神经营养作用的再次肯定；同时融合基因克隆的成功，以及在原核细胞系统中的正确表达和加工，为我们进一步将NT4-NAP重组入真核细胞系统，在体内外瞬时表达NAP；或将其重组入腺相关病毒（AAV），在体内外长期表达NAP，从而构建一种神经保护肽的体内分泌表达策略奠定了基础。这也为其他神经营养短肽的应用提供了新的线索，为AD基因治疗的下一步研究提供理论基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R749.16

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈娜莎;华荣虹;闫丽萍;赵付荣;王斌;杜鹃;王云峰;童光志;;乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析[J];中国预防兽医学报;2011年07期

2 饶志勇;蔡木易;潘兴昌;谷瑞增;李国平;胡雯;;创伤专用型短肽营养制剂在重症颅脑损伤患者中的临床应用观察[J];海南医学院学报;2011年07期

3 李向阳;张嘉保;何永聚;王景龙;;CD4~+T细胞表位预测及其应用[J];安徽农业科学;2011年17期

4 张勇胜;舒晓亮;钟静霞;申颖;孟蓓蕾;;肠外与肠内联合营养治疗重症急性胰腺炎[J];第二军医大学学报;2011年07期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相关会议论文 前10条

1 余喜讯;许映霞;孙璐;段军鸿;蒋根杰;乐以伦;;一种带SDE短肽的新型吸附剂及其在吸附血浆中LDL的性能——Ⅳ带SDE短肽聚丙烯酰胺微球吸附血浆中LDL的初步研究[A];第九届全国生物材料学术会议（CBMS-9）论文集[C];2002年

2 昝学琴;顾(占力)玮;黄红;陈岚;;短肽营养剂在颈部吻合口瘘病人中的应用[A];中国营养学会第九届临床营养学术会议论文摘要汇编[C];2003年

3 乐国伟;施用晖;;生物活性短肽在动物生产中的应用前景[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年

4 许映霞;余喜讯;蒋根杰;乐以伦;;一种带SDE短肽的新型吸附剂及其吸附血浆中LDL的性能——Ⅱ SDE短肽的合成与检测[A];第九届全国生物材料学术会议（CBMS-9）论文集[C];2002年

5 余喜讯;许映霞;孙璐;段军鸿;乐以伦;;一种带SDE短肽的新型吸附剂及其吸附血浆中LDL的性能——Ⅲ 带SDE短肽的LDL吸附剂的制备[A];第九届全国生物材料学术会议（CBMS-9）论文集[C];2002年

6 刘红岩;杨贵贞;;VCAM—1核心表位的噬菌体短肽用于EAE的实验性治疗[A];第七届中国抗炎免疫药理学术会议论文摘要集[C];2000年

7 赵强;左斌海;刘建伟;万昌秀;乐以伦;;生物活性短肽RGD在PET膜表面接枝方法研究[A];21世纪医学工程学术研讨会论文摘要汇编[C];2001年

8 余喜讯;许映霞;段怡飞;薛斌;乐以伦;;一种带SDE短肽的新型吸附剂及其吸附血浆中LDL的性能——Ⅰ聚丙烯酰胺微珠的合成与表征[A];第九届全国生物材料学术会议（CBMS-9）论文集[C];2002年

9 李富伟;蔡辉益;刘国华;常文环;于会民;张姝;;寡肽对肉鸡生长性能的影响及其机理研究(摘要)[A];中国畜牧兽医学会2003年学术年会论文集[C];2003年

10 李文君;陈政良;;从环七肽库筛选C1q结合短肽[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

相关重要报纸文章 前10条

1 张中桥;胃癌耐药细胞特异性结合短肽筛选成功[N];中国医药报;2006年

2 记者　 陈敬农 通讯员　 胡胜友;我科学家发现输运大分子药物的透皮短肽[N];科技日报;2006年

3 吴然;胃癌耐药细胞特异性结合短肽筛选成功[N];医药经济报;2006年

4 林英;我科学家找到治疗糖尿病新途径[N];光明日报;2007年

5 记者王薇;杏仁功能短肽制备实现创新[N];中国食品报;2011年

6 本报特约记者 尹燕波;走过“非常时期”[N];大众科技报;2003年

7 本报记者　 赖强;中国透皮制剂市场等待唤醒[N];医药经济报;2006年

8 记者　刘纯友 通讯员　胡胜友;中科大发现糖尿病给药新途径[N];安徽日报;2006年

9 王伟中;战胜SARS病毒需加强国际合作[N];科技日报;2003年

10 王雪飞;抗非典多肽药物离我们有多远[N];健康报;2003年

相关博士学位论文 前10条

1 王春艳;杏仁短肽制备及其降血压活性研究[D];中国农业科学院;2011年

2 林涛;胃癌MDR细胞特异性结合及耐药逆转短肽的筛选[D];第四军医大学;2006年

3 张宇昊;花生短肽制备及其功能活性研究[D];中国农业科学院;2007年

4 陆琳;人子宫内膜癌细胞系的建立及其特异性结合短肽的筛选[D];暨南大学;2005年

5 杨璞;肝癌靶向多肽的筛选及X1/MePEG-PLA-CS纳米粒的靶向性研究[D];中南大学;2010年

6 金洪娟;MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究[D];吉林大学;2011年

7 郝文波;噬菌体肽库技术筛选特异阻断恶性疟原虫感染红细胞粘附短肽的研究[D];第一军医大学;2002年

8 孙伟;利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶抑制剂[D];上海医药工业研究院;2004年

9 李文涵;肝癌细胞系HepG2特异性结合短肽的筛选及其特异性研究[D];华中科技大学;2007年

10 李雪松;整合素αvβ3特异性结合短肽筛选及功能分析[D];第三军医大学;2009年

相关硕士学位论文 前10条

1 杨宇;神经营养素4与神经保护短肽NAP融合基因克隆及表达的研究[D];吉林大学;2004年

2 王冰;应用噬菌体展示技术筛选与胶质瘤细胞特异性结合的短肽[D];暨南大学;2004年

3 左斌海;含RGD序列短肽的合成及其合成工艺的优化[D];四川大学;2002年

4 付清泉;具有多种生物活性的GRGD四肽和GRGDS五肽的合成研究[D];四川大学;2003年

5 任君萍;噬菌体表达短肽模拟日本脑炎病毒糖蛋白的研究[D];第四军医大学;2001年

6 赵强;生物活性短肽RGD的合成及其在PET表面接枝方法的研究[D];四川大学;2001年

7 王鹏;胃癌耐药细胞SGC7901/VCR特异性结合短肽的环七肽库筛选[D];第四军医大学;2006年

8 张彦琼;肝癌细胞特异性结合短肽的噬菌体肽库筛选[D];中南大学;2007年

9 李文君;具C1q抑制活性C1q结合短肽的研究[D];第一军医大学;2002年

10 梁树辉;胃癌血管内皮细胞特异结合短肽的噬菌体肽库筛选[D];第四军医大学;2005年

本文编号：2725358