用噬菌体随机多肽展示技术筛选阿尔茨海默病相关β-分泌酶的抑制剂

发布时间：2020-06-25 03:04

【摘要】： 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease; AD)是常见的中枢神经系统退行性疾病之一,其主要病理特征是在大脑易受损区域的细胞内形成神经纤维缠结(NTF)和细胞外形成的淀粉样斑块(amyloid plaques),又称老年斑。AD的主要临床症状是进行性记忆缺失,精神行为异常以及认知功能障碍等。据美国权威机构发表的2007年度AD病评估报告显示：有510万美国人患有AD病,其中年龄在65岁以上者约占96%,这部分人又称为晚发型(late onset),有20万的患者是遗传因素所致的,其年龄小于65岁,为早发型患者(early onset),预计到2050年AD患者的人数将增加三倍。AD患者死亡率已在全美五大最高死亡率疾病中排名第三。目前,我国的AD病人资料也与西方国家接近。因此,AD己成为严重威胁老年人生命质量的疾病之一,现在已成为国际上中枢神经退行性疾病研究的热点。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein; APP)是研究最为广泛AD相关蛋白,它的酶解产物在AD病的致病机理中起着非常重要的作用。APP有三种异构体,分别包含770,751和695个氨基酸,APP是跨膜蛋白,在膜上受两个相邻的膜内蛋白酶β-分泌酶(BACE1, Asp2, Memapsin)和Y-分泌酶的先后切割而产生三个肽段：1)sAPPβ,为分泌至细胞外的可溶性APP。2) Aβ,为AD的主要毒性产物,含42肽可在神经元及突触之间大量蓄积,形成淀粉样斑块,从而导致大脑功能受损,出现相应的临床症状；3) AICD(APP intracellulardomain),即APP细胞内功能区。针对这一致病机理,许多研究者将降低A p的分泌或其病理聚集,或者是有效清除病理聚集的Aβ斑块作为治疗AD的重要靶点。减少Aβ的分泌可以通过降低β-分泌酶活性或者γ-分泌酶活性的途径实现 β-分泌酶是一种Ⅰ型跨膜天冬氨酰蛋白酶,与它的异构体BACE2同属于胃蛋白酶家族。β-分泌酶位于11号染色体上,由501个氨基酸组成,N端的21个氨基酸组成其信号肽。22-45是未成熟蛋白段,46-460是成熟蛋白,其后是细胞内的17个氨基酸。BACE1含有两个活性位点在氨基酸93-96和289-292处,每个活性位点都包括高保守序列DT/SGT/S。BACE1序列中含有4个糖基化位点以及六个半胱氨酸以形成三个二硫键来维持其空间结构。科学家在β-分泌酶基因敲除老鼠中发现,这些老鼠健康且多产,在组织学,血液学以及临床化学上与对照组野生型老鼠没有明显的表型差异,而γ-分泌酶则是由四个跨膜蛋白即早老素,nicastrin, APH1和PEN2构成的一个蛋白酶复合体,除了参与Aβ的生成外还参与了其它的信号转导过程,如Notch信号途径,如果干预γ-分泌酶可能会影响到其它生理过程,产生不利的结果,相较而言,抑制β-分泌酶是抗APP途径更为有利药物靶点。目前,已经报道的β-分泌酶抑制剂有很多,但是还没有一利·药物能够真正运用到临床上来解决患者的痛苦。噬菌体展示技术(Phage display technology)是一种简便有效的淘选酶抑制剂的方法。噬菌体展示是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术,他以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质的基因区,使外源多肽或蛋白质以融合的形式表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲法富集表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。其基本步骤包括：1)构建起始噬菌体库,即在噬菌体pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面,不影响和干扰噬菌体的生活周期,同时保持的外源基因天然构象,也能被相应的抗体或受体所识别,或者扩增已构建好的库；2)利用固定与固相支持物的靶分子,将噬菌体颗粒暴露于靶分子下,使其与靶分子特异性结合,洗去非特异结合的噬菌体,筛选出目的噬菌体；3)扩增目的噬菌体,再次将其与靶分子结合／扩增,经过3-4轮的循环后,外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来；4)将得到的序列进行重组或合成多肽,分析其与靶分子的亲和选择性,最终得到理想的蛋白或肽。文献报道利用噬菌体展示技术成功的筛选到绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) MurC酶,MurD酶和MurF酶的抑制剂,为抗生素的发展提供了重要的物质基础。并且噬菌体展示技术也成熟的运用到β-内酰胺酶(β-lactamase)抑制剂的筛选中。根据上述资料,我们采用噬菌体随机多肽展示技术来筛选β-分泌酶的抑制剂,通过抑制剂阻断β-分泌酶对其底物APP的切割来降低Aβ的产生,从而为阿尔茨海默病的治疗提供一定的物质基础。在筛选抑制剂之前,首选要建立一个能够检测抑制剂活性的体外平台。我们通过PCR的方法从人脑基因库中扩增出BACE1基因,在其N端加入肠激酶酶切位点,C端加入6×His tag,将扩增出的片段插入带有绿荧光蛋白的pEGFP-C3载体的多克隆位点上,将构建的质粒(BACE1/pEGFP-C3)用脂质体转染至HEK293细胞中表达,24小时后收集并裂解细胞,离心后取上清液,利用亲和色谱法(TALON Mental Affinity Resins)纯化绿色荧光蛋白／BACE1融合蛋白,用肠激酶常温下酶切BACE1融合蛋白过夜,将酶切产物再次过柱分离,从而获得纯化的BACE1蛋白。用BACE1活性检测试剂盒验证纯化蛋白的活性,即利用荧光能量共振转移的方法,有活性的蛋白酶切割荧光底物后,底物与荧光基团分离而产生荧光,根据荧光信号的强弱来判断蛋白酶是否有活性,并且可利用此种方法来检验BACE1抑制剂的抑制作用。将纯化的BACE1加入到含有荧光底物的96孔板中,37℃孵育2h,检测荧光值的大小来判断BACE1的活性。经过统计分析,纯化BACE1组的荧光值1587.115±138.4868(n=3)与标准BACE1组的荧光值1836.629±154.195(n=3)比较,P=0.247,两组无显著性差异,说明纯化的BACE1在体外具有活性。将构建的BACE1/pEGFP-C3质粒和已有的APP/pDsRed-Monomer-N1质粒用脂质体共转至HEK293细胞中表达,24h后收集并裂解细胞,用Western blotting的方法检测BACE1切割其底物APP的效果,结果可以看到CTFAPP 0这一条带的出现,提示BACE1在细胞内具有酶切活性。这就为后续的抑制剂实验提供了细胞水平上的检测平台,我们可以通过观察BACE1在细胞水平对APP的切割效果来判断筛选出的抑制剂是否有抑制活性。由于小肽分子量小具有较好的穿透性,同时免疫源性相对也较小而利于实际应用,所以我们选择从Ph.D.-C7CTM噬菌体七肽库中筛选BACE1的抑制剂。经过第一次的淘选后,挑取11个克隆测序,结果发现有五个克隆的序列是相同的,即Peptide-1 (CPLHARLLC).我们将这个序列合成为二硫键环化的七肽,将其溶解于蒸馏水中,稀释为100nM,1000nM,10,000nM,100,000nM和1,000,000nM五个浓度,用前面荧光能量共振转移的方法在体外对其抑制活性进行了检测。经统计分析后,五个浓度组的Peptide-1分别与没有加抑制剂的BACE1组比较,P0.05,说明Peptide-1对BACE1没有明显的抑制效果。我们又进行了两次筛选,得到Peptide-2 (CGYPSLHAC),合成了三种不同的结构,并进行了抑制实验,均未有明显的抑制活性。我们所获得的克隆序列均可和BACE1分子结合,我们的任务就是从余下的克隆中继续筛选找到具有抑制活性的七肽序列并将其运用到细胞水平和动物水平上。目前我们在改进的基础上已对再次获得的结合肽序列进行了测序,为再一次的抑制剂筛选提供了物资基础。该实验目前正在进行中。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.16
【图文】：

肠激酶,洗脱液,融合蛋白,第二次

图 1BACEI的克隆、表达和纯化。A，RCR扩pEGFP一e3的RCR鉴定;C，纯化BACEI蛋白次beads洗脱液的分析，LaneZ是第二次pEGFP一BACEI融合蛋白，Lane4是肠激酶酶 Fig.1Cloning， ExPressingandPurifyingBACE IdentifieationofBACEI/PEGFP一 e3reeombina PurifiedBACEIbyWestemblotting:Lanel， analysisoftheseeondwashbuffer;Lane3，Puri BACEIaftercleavagedbyenterokinase.2.BACEI活性检测

ELISA检测,噬菌体,异性,特异性

结果3.3PhageELISA我们共挑取了n个克隆进行测序，结果显示c3，e6，e7，es这五个克隆序列相同，即CPLHARLLC。我们用ELISA的方法CPLHARLLC与BACEI结合的特异性，结果如图4所示，BACEI组的0DMBP对照组oo值相比，只0.01，有显著性差异，提示CPLHARLLC与BA异性结合。

【参考文献】