稳定表达hOCT2细胞模型的构建及OCT2在抗抑郁机制中的作用

发布时间：2020-06-28 20:50

【摘要】：抑郁症是一种严重危害人类身心健康的常见疾病,随着人们生活压力的增大及工作节奏加快,抑郁症的发病率逐年上升,该病不仅困扰患者的生活和工作,也对其家庭和社会带来沉重的负担,因此对于该病的治疗及发病机制的研究也日益受到重视。在过去几十年里,抑郁症治疗已经取得了突破性进展。现行的临床常用抗抑郁药物,主要通过靶向阻断大脑中5-羟色胺和去甲肾上腺素高亲和性转运体对单胺神经递质的重摄取,发挥药理功能。然而,仍有相当大比例的患者未能获得良好的治疗效果。因此,社会人群亟待起效快、收效明显和耐受性好的新型抗抑郁药物或者治疗方案。 近期研究中,有机阳离子转运体2(OCT2, SLC22A2)作为高亲和性转运体的一个补充体系而受到关注。OCT2对单胺神经递质虽然亲和力低但摄取容量大,是后突触上胺能神经紧张的重要决定因素之一,能调节与情绪相关的一系列行为。为了评价抑制OCT2能否有助于抗抑郁药物药理活性发挥,我们首先构建了稳定表达人源性OCT2的细胞模型,并从mRNA表达、蛋白表达和摄取功能3个水平验证细胞模型的可靠性。摄取功能考察中,先以荧光底物ASP+初步筛选,再用OCT2经典底物二甲双胍和MPP+进一步确证。 选择mRNA和蛋白水平验证阳性且摄取功能最强的细胞模型,扩大培养,当作实验对象。抑制实验受试的前线抗抑郁药物,包括选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(氟西汀、舍曲林和帕罗西汀)、三环类抗抑郁药(阿米替林、丙咪嗪和地昔帕明)、单胺氧化酶抑制剂(吗氯贝胺)和5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(文拉法辛)。上述经典抗抑郁药对OCT2介导的二甲双胍、5-羟色胺和去甲肾上腺素有抑制作用,但在生理浓度下抑制程度微弱,反面提示OCT2在抗抑郁治疗中的重要地位。SSRIs(对二甲双胍和5-羟色胺的IC5o范围1-10μM)和TCAs(对二甲双胍和去甲肾上腺素的IC50范围约为100nM-1μM)比较强,吗氯贝胺(对二甲双胍和5-羟色胺的IC50范围10-100μM,对去甲肾上腺素大于100μM)次之,文拉法辛(对三种底物的IC50均大于100μM)相对最弱。其中,舍曲林和地昔帕明虽然竞争性抑制OCT2活性,但由于在进细胞过程中,被动扩散的效果大于转运而不易被察觉。所以,抑制OCT2在抗抑郁药物药理活性中不容小觑,尽管在临床实际操作中对总体治疗效果仍需考查。 我们从一系列报道的抗抑郁样中药单体中,筛选出胡椒碱、小檗碱和药根碱这三种OCT2抑制剂。考查这三种生物碱对OCT2和OCT3介导的二甲双胍、5-羟色胺和去甲肾上腺素摄取能力的影响,发现生物碱的抑制效果显著。接着,制备鼠源突触小体,考查以OCT为代表的uptake2体系相对于以高亲和性转运体为代表的uptake1体系对抗抑郁机制的贡献。实验结果,肯定了OCT机制的重要性。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.4
【图文】：

- ‘逆b/图2.1琼脂糖凝胶电泳鉴定卩\1019-丁-110(：丁2质粒。图2.1八为环形质粒的完整状态；图2.1 B为质粒BamHI/XhoI双酶切后。采用Marker III指征质粒大小，平行两份上样。2.3.2. hOCT2A27os突变体基因的构建定点突变后，用Dpnl酶，37 °C,消化Ih,除去摸板质粒，将突变产物转入大肠杆菌DH 5a感受态细胞，次日挑单菌落摇菌，提质粒（见图2.2 A),双酶切鉴定（见图2.2 B),得到长度为2.7 kb，1.7 kb的两个片断，分别对应载体和目的基因的大小

2000 2000图2.2琼脂糖凝胶电泳鉴定pMD19-T-hOCT2A2TOS质粒。图2.2 A为环形质粒的完整状态；图2.2 B为质粒BamH I/Xlio I双酶切后。采用Marker III指征质粒大小，平行两份上样。2.3.3.真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-hOCT2 和 hOCT2A270s 的构建将连接产物转化入大肠杆菌DH 5a感受态细菌。转化次日，挑取单菌落，摇菌，抽提质粒，电泳鉴定（见图2.3 A和2.4 A)，双贿切鉴定（见图2.3 B和2.4 B)，均得到约为5.4 kb的pcDNA3.1(+)载体片度和约为1.7 kb的目的基因片段，初步鉴定质粒正确。将鉴定正确的质粒测序，测序结果表明pcDNA3.1(+;)-hOCT2和hOCT2A270s质粒构建成功。28

本文编号：2733441