VPS34泛素化机制研究及其与阿尔兹海默病关系探讨

发布时间：2020-07-01 10:29

【摘要】：VPS34(Vacuolar protein-sorting 34)在自噬和内体转运中发挥了重要的作用。在AD患者脑组织及其病理模型鼠APP/PS1小鼠脑组织中,VPS34激酶活性降低,并且VPS34会影响APP内吞转运。提示VPS34与AD发病机制有关。我们推测VPS34泛素化会改变其蛋白水平。但是,我们研究发现VPS34泛素化并不影响其蛋白水平。使用泛素野生型质粒及其各位点突变质粒与VPS34瞬时共转染HEK293细胞,发现VPS34可以发生各种类型的多聚泛素化修饰。泛素野生型及各突变位点质粒转染HEK393细胞,内源性VPS34蛋白水平没有改变。并且,我们发现VPS34既可以通过蛋白酶体也可以溶酶体途径降解,使用蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂氯喹的干预下,VPS34蛋白水平在12和18小时没有改变,但在24小时明显升高,表明VPS34在18小时内相对稳定。在6、12月龄APP/PS1小鼠脑组织中,Vps34蛋白水平保持不变,但是VPS34的泛素化水平明显降低,表明VPS34的泛素化和蛋白水平的改变在APP/PS1小鼠中不一致。这些结果表明VPS34泛素化修饰不改变其蛋白水平。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16
【图文】：

鼠尾,小鼠,基因,制胶

⑹ 取上述 DNA 模板，配置反应体系，跑 PCR，PCR 程序为 95℃ 5min，95℃15S 60℃ 15S 72℃ 20 S，72℃ 10min，PCR 体系为：Taq mix 2* 10ul灭菌双蒸水 6 ul引物 F/R 2ul鼠尾 DNA 2ul⑺ 配置 1.5%琼脂糖胶：0.5* TBE 100ml琼脂糖 1.5ggoldview 5ul入微波炉高火 2min，取出，待温度降至 60-70℃左右倒入制胶模具。⑻ 上样，按顺序加入 100bp DNA maker，PCR 产物。电泳 120 V，30min。于Fusion 成像显影，350bp 与 608bp 均有条带即为 APP/PS1 双转小鼠。

泛素化

图 1 泛素化修饰不改变 VPS34 蛋白水平Figure1 Ubiquitnation does not alter Vps34 protein levels(A) Representative Western blots of HA-tagged ubiquitin (top) and Flag-tagged VPS34 (bottn HEK293 cells co-transfected with VPS34 and ubiquitin constructs WT, K0, K6, K11, K29, K48 and K63, respectively.After 44 h of transfection, cells were treated with MG132 (20 M) for efore harvest. (B) Representative Western blots of HA-tagged ubiquitin (top) and Flag-taggPS34 (bottom) in cell extracts immunoprecipitated by Flag-Vps34 antibody. Samples were takrom A. (C) Representative Western blots of ubiquitin (HA-tag) in HEK293 cells transienxpressing vector, or ubiquitin constructs WT, K0, K6, K11,K27,K29, K33, K48 and Kespectively. Cells were treated with MG132 (20 M) for 4 h before sample was harvested. (epresentative Western blots (top) and quantification (bottom) of endogenous Vps34 in sampaking from C.

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