TREM2与A192T突变在阿尔茨海默病进程中的作用研究

发布时间：2020-07-02 11:17

【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人中最常见的一种痴呆症,p淀粉样肽(Amyloid β-peptide,Aβ)的异常聚集和AD的发病密切相关。研究表明 2 型髓样细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)可能通过增强小胶质细胞吞噬功能来参与Aβ的清除。炎症反应和小胶质细胞的功能与AD的发病进程密切相关。TREM2主要表达于小胶质细胞和巨噬细胞等髓系细胞。全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)发现,TREM2基因的一些突变会显著增加AD的患病风险,但是其作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨TREM2及突变体在AD的进程中的作用。方法:(1)用电化学发光(meso scale discovery,MSD)方法检测不同年龄的AD模型小鼠(APP/PS1)和野生型小鼠(WT)脑组织内细胞因子表达量的变化。(2)用组织多色免疫荧光标记技术检测小鼠脑组织切片内Aβ和TREM2的表达情况。(3)用Western blot方法检测不同年龄的AD模型小鼠(APP/PS1)和野生型小鼠(WT)脑组织内TREM2、Aβ和小胶质细胞标志物(Iba-1)表达量的变化。(4)利用Spearman分析的方法,对AD模型小鼠(APP/PS1)脑组织内Aβ、TREM2和细胞因子表达量的变化进行相关性分析。(5)用PCR和全外显子测序的方法从汉族AD患者外周血标本中筛选TREM2基因突变。(6)用pEGFP-N1载体构建3个TREM2及突变体表达质粒,并转染HEK293细胞。(7)通过Western blot和双抗体夹心ELISA方法检测并分析突变对TREM2表达水平、细胞内代谢、糖基化修饰及细胞活力的影响。(8)用CCK-8试剂盒检测细胞活力,并根据公式计算细胞存活率。结果:(1)MSD结果表明,相同周龄下,与野生型(WT)小鼠相比,AD模型小鼠(APP/PS1)脑组织内的细胞因子(TNF-a,IL-1β,IL-6,IL-12,IL-4 和 IL-10)表达水平未见显著差异。(2)多色免疫荧光和Western blot结果表明,相同年龄下,与野生型(WT)小鼠相比,AD模型小鼠(APP/PS1)脑组织内Aβ(Aβ斑块,Aβ寡聚体和 Aβ42)的表达量显著增加(APP/PS1:43.52±8.8,WT:19.6±2.55,p0.05);在APP/PS1小鼠中,Aβ的表达量随年龄增长而增加;在16w以上的APP/PS1小鼠中,TREM2的表达量随年龄增加,24 w与3 w相比显著增加(3 w:2.22±0.71,24w:5.45±1.28,p0.05);与WT小鼠相比,在APP/PS1小鼠中,小胶质细胞标志物 Iba-1 的表达量在 16 w 时显著增加(APP/PS1:0.0446±0.0126,WT:0.0212±0.0062,p0.05)。(3)AD模型小鼠(APP/PS1)脑组织中TREM2分别与细胞因子(TNF-α和IL-1β)、Aβ(Aβ寡聚体和Aβ42)之间显著正相关(TNF-α和IL-1β与 Aβ 相关系数 r0.5,p0.05;TNF-α 和 IL-1β 与 TREM2 相关系数 r0.5,p0.05;TREM2与Aβ相关系数r0.5,p0.01)。(4)通过PCR和全外显子测序,从汉族AD患者外周血标本中发现TREM2突变p.A192T。(5)Western blot结果显示,TREM2-FL-EGFP的主要条带位于50kDa附近,TREM2-CTF-EGFP的主要条带位于35 kDa附近。糖基化的TREM2条带则位于50～80 kDa之间。与TREM2-WT相比,TREM2-R47H突变组,总蛋白中TREM2和上清中sTREM2中表达量显著升高(WT:621±158.99,R47H:1178.78±102.05,P0.05),糖基化修饰没有显著变化;与TREM2-WT相比,TREM2-A192T突变组,上清中sTREM2表达量显著性增加(WT:621±158.99,A192T:832.11±110.67,P0.05);糖酶处理后残余的糖基化条带显著增加(WT:0.22±0.27,A192T:0.81±0.23,p0.05);细胞存活率显著增强(WT:32.53±2.03,A192T:65.6±12.66,p0.05)。结论:(1)筛选出汉族AD患者TREM2基因突变p.A192T,并构建了表达质粒。(2)AD模型小鼠脑组织TREM2表达水平分别与炎症细胞因子(TNF-α和IL-1 β)和病理性Aβ含量成正相关,表明TREM2可能通过炎症反应参与AD的进程。(3)在HEK293细胞中,A192T突变增加了 sTREM2表达水平,并与TREM2糖基化修饰的改变相关,可以提高细胞存活率。提示其与降低细胞存活率的AD进程无明显关系。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16

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本文编号：2738132