Gαi介导MANF（中脑星形胶质细胞源性神经营养因子）信号转导调控小鼠焦虑样行为的作用和机制研究

发布时间：2020-08-03 12:21

【摘要】：研究目的1.解析Gαi介导MANF信号转导的分子机制;2.明确小鼠海马区Gαi1/3表达水平和焦虑行为的相关性。研究方法培养野生型(WT),Gαi1/3双敲除型(DKO),Gαi1单敲型,Gαi3单敲型,Gαi2单敲型的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)以及Gab1敲除的MEFs细胞;运用shRNA方法在MEFs中靶向敲减Gαi1和/或Gαi3;在DKO MEFs细胞中重新导入Gαi1和Gαi3的表达质粒,获得Resure1和Resure3 MEFs;分别用MANF对上述MEFs细胞进行处理,检测细胞中下游接头蛋白Gab1以及 AKT-mTORC1 信号通路(Akt,S6,S6K,GSK3α/3β)和 MAPK/ERK 信号通路(Erk)的活化水平;利用shRNA慢病毒干扰技术,通过小鼠脑立体定位方法,在SPF级ICR雄性小鼠海马区注射干扰病毒,检测小鼠焦虑样行为的变化。结果MEFs 中,Gαi1/3 双敲(DKO)阻断了 MANF 诱导的 AKT-mTOR/ERK-MAPK信号通路的活化;Gαi-shRNA、Gαi1-KO、Gαi3-KO 的 MEFs 在 MANF 刺激后,下游信号都有轻微减弱,Gαi2-KO的MEFs在MANF处理后,下游信号没有显著变化;Resure1和Resure3 MEFs,在MANF刺激后,下游信号活化有明显的恢复;Gab1敲除的MEFs,在MANF刺激后,表现出下游AKT-mTORC1信号通路(AktSer473,S6,S6K)和MAPK/ERK信号通路(Erk)活化水平的大幅度降低甚至缺失;小鼠海马区注射Gαi1/3-shRNA慢病毒后,焦虑样行为显著增加;小鼠海马区注射慢病毒包裹的Gαi1/3突变质粒(DN),焦虑样行为增加,但没有明显的认知障碍,而注射持续活化的Gαi1/3(CA),小鼠没有表现出明显的焦虑样行为。结论1.体外结果提示Gαi1/3可能介导MANF诱导的下游信号转导;2.行为学结果表明海马区Gαi1/3可能参与调控小鼠焦虑样行为。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.72
【图文】：

逡逑ａ，ｂ：指定浓度的ＭＡＮＦ处理ＷＴ和Ｇｏｄｌ＋３－ＤＫＯＭＥＦｓ指定时间，ｃ，ｄ：不同逡逑浓度的ＭＡＮＦ处理ＷＴ和Ｇａｉ－ｌ＋３－ＤＫＯ邋ＭＥＦｓ指定时间，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测上述蛋白逡逑的表达；＊＊＊／＞＜Ｏ．Ｏｌｖｓ．ＷＴ。逡逑２０逡逑

游ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣｌ信号通路中的标志性蛋白（Ａｋｔ，Ｓ６，Ｓ６Ｋ，ＧＳＫ３ａ，ＧＳＫ３ｐ）磷逡逑酸化水平严重降低甚至缺失，ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信号通路中的标志性蛋白（Ｅｒｋ）的磷酸化逡逑水平也严重降低甚至缺失（图２）。逡逑１９逡逑

（５０ｎｇ／ｍｌ）处理不同时长（分别为对照、７ｍｉｎ、１５ｍｉｎ）后，用裂解液提取细胞蛋白，逡逑用邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋方法检测不同处理情况下，ＡＫＴ／ｍＴＯＲＣｌ邋（Ａｋｔ，Ｓ６，邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３ｐ）逡逑和ＭＡＰＫ／ＥＲＫ邋（Ｅｒｋ）信号通路表达差异，结果显示（图５）：与ＷＴＭＥＦｓ细胞相比，逡逑ｓｈＲＮＡＭＥＦｓ邋细胞中

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本文编号：2779618