二十二碳六烯酸对β淀粉样蛋白25-35致皮层神经元损伤的保护作用

发布时间：2020-08-14 11:00

【摘要】： 目的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种严重的中枢神经系统退行性疾病,β淀粉样蛋白(amyloid beta protein,Aβ)及其聚集形成的老年斑(senile plaques,SPs)是AD特异性病理学变化,Aβ聚集后有广泛的毒性,被认为是AD的关键致病物质。大量研究证实Aβ对多种细胞有毒性作用,尤其是海马和皮层神经元。因此预防和拮抗Aβ的神经毒作用是预防和治疗AD的重要靶点。研究表明Aβ的直接毒性作用与神经元细胞的钙稳态失衡有关,表现为神经元细胞内游离钙离子浓度的显著升高。二十二碳六烯酸(Ducosahexaenoic acid,DHA)是一种多不饱和脂肪酸,主要从深海鱼和藻类中提取出来,是大脑皮层灰质神经元细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的主要组分。大量流行病学调查及体内试验发现DHA对AD的认知损害有保护作用,DHA能有效抑制Aβ的神经毒作用,起到神经保护、抗凋亡等作用。我们以往的实验观察到DHA的减少可以加重炎症反应和促进神经元半胱氨酸蛋白酶(caspase)活化而加剧细胞凋亡。本实验设计旨在观察DHA对β淀粉样蛋白25-35(Aβ_(25-35))致原代培养皮层神经元损伤的保护作用,观察DHA是否通过作用于Aβ诱导的神经元钙超载,对Aβ神经毒作用产生保护,以进一步研究DHA发挥神经保护作用的机制或途径。方法 1.原代皮层神经元培养:取新生1天的Wistar大鼠大脑皮层组织,制成的细胞悬液接种于经过L-多聚赖氨酸包被的96孔板或培养皿中,置于37℃下5%CO_2培养箱孵育至第7DⅣ(dav in vitro,DⅣ)分5组进行试验。 2.实验分组: (1)对照(Control)组:不加任何处理因素; (2)Abeta组:凝聚态Aβ_(25-35)(25μM); (3)低剂量DHA-Abeta组:DHA(20μM)+凝聚态Aβ_(25-35)(25μM); (4)中剂量DHA-Abeta组:DHA(50μM)+凝聚态Aβ_(25-35)(25μM); (5)高剂量DHA-Abeta组:DHA(100μM)+凝聚态Aβ_(25-35)(25μM)。在培养至第7 DⅣ的DHA组皮层神经元培养液中加入DHA,维持DHA终浓度为20、50、100μmol/L,培养24小时后按检测要求慢性孵育终浓度为25μmol/L Aβ_(25-35)24小时或者急性给予终浓度为25μmol/L Aβ_(25-35)。 3.检测方法: (1)用CCK-8比色法观察神经元存活率; (2)用激光共聚焦显微镜观察标记有荧光染料Fluo-3/AM(5μM)的神经元细胞内游离钙离子浓度的变化(用细胞内游离钙离子相对荧光强度(F/F_b)的变化表示)。 4.统计学处理: 所有统计数值以均数±标准差((?)±s)表示,用SPSS13.0统计软件处理,不同处理组之间的检验采用单因素方差分析,方差齐者组间比较用LSD(least significant difference)检验,方差不齐组间比较用Games-Howell检验,检验水准α=0.05,P＜0.05表示有显著性差异。结果 1.DHA拮抗Aβ诱导的皮层神经元形态学改变皮层神经元原代培养至第8DⅣ时(已按分组要求于第7DⅣ加入低、中、高剂量的DHA培养24小时),按分组要求加入凝聚态Aβ_(25-35)继续培养24小时。与对照组相比,Abeta组神经元表现出明显的神经毒作用,即Abeta组中多数细胞胞体肿胀呈圆形,神经元突起消失明显,神经元由贴壁生长转为悬浮生长,有大量死细胞;而提前孵育不同剂量DHA的三组细胞与Abeta组相比有显著差别,上述毒性作用基本消失,低剂量及高剂量组中仅少数细胞出现了不同程度的神经元突起回缩、神经纤维网络变稀疏,中剂量组则细胞生长旺盛,突起数目多、长度长,网状结构复杂。上述结果表明DHA对Aβ诱导的神经毒作用(神经元形态结构改变)有一定的抑制作用,其中中剂量DHA抑制作用最强。 2.DHA对Aβ_(25-35)诱导的神经元存活率下降的拮抗作用与对照组相比,Abeta组神经元存活率明显下降(n=8,P＜0.05);孵育DHA可降低Aβ_(25-35)引起的神经元存活率下降(n=8,P＜0.05),不同DHA剂量组比较差异有显著性,中剂量DHA作用最强(n=8,P＜0.05)。 3.DHA对Aβ_(25-35)诱导的神经元钙超载的拮抗作用与对照组相比,Abeta组神经元细胞内游离钙离子浓度显著持续升高(n=15,P＜0.05);孵育DHA可降低Aβ_(25-35)诱导的神经元细胞内游离钙离子浓度升高(n=15,P＜0.05),不同DHA剂量组比较差异有显著性,中剂量DHA作用最强(n=15,P＜0.05)。结论 1.Aβ_(25-35)可引起体外原代培养皮层神经元存活率下降及胞内游离钙离子浓度的显著持续升高; 2.Aβ诱导的钙超载可能是Aβ神经毒作用的重要方面; 3.DHA可部分拮抗Aβ_(25-35)诱导的钙超载,可能是DHA拮抗Aβ神经毒作用发挥保护作用的重要机制。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R749.16
【图文】：

相对荧光强度,国名,对照组,林相

注:与*相比:林p<0.05，#p<0.05，##p<0.05，###p<0.05;与林相比:#p<0.05，##p<0.05，<0.05:与#相比，##p<0.05，###p<0.05.图2一:各组细胞内游离钙离子相对荧光强度在给予Ap后升高(对照组除外)井随时间延长达，。8ssseCO.trolll一一A加taaaLLLoWDRA·Abetaaa一一M汤ddleDHA.Abetaaa——H啥bDHA一betaaa伽扩lr1JJ1.............ZSM幼2.o:6注.o月.月.月.曰.萝炭9.月名，留舒。爪‘国弓.国名感蓄

【引证文献】