创伤后应激障碍大鼠蓝斑核受体-GR，MR的表达及神经元凋亡的研究

发布时间：2020-08-20 06:21

【摘要】： 目的 创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, PTSD)是对刺激因素的一种异常精神反应。尽管进行了大量的神经生物学研究,但目前对PTSD的发病机制还不是十分清楚。PTSD临床表现多样,主要包括创伤经历再体验、情感麻木与回避行为、警觉增高所致易激惹症状三大症候群。这些症状表明PTSD患者可能存在血中皮质醇水平增高的现象。然而,大量研究表明PTSD患者血中皮质醇水平比正常人低。目前,在其他抑郁症的患者中主要存在皮质醇负反馈的抑制,PTSD患者却有负反馈增强的现象。目前报道PTSD患者尿中去甲肾上腺素和肾上腺素的排泄量明显增加。蓝斑是去甲肾上腺素的主要集中地,另外,蓝斑还参与睡眠障碍,警觉过度,易激惹等PTSD临床症状。 皮质类固醇受体包括糖皮质激素受体(GR,Ⅰ型),和盐皮质激素受体(MR,Ⅱ型)。MR是高亲和力和低容量的糖皮质激素受体系统,而GR和高容量的糖皮质激素受体系统。GR在应激后糖皮质激素的生理上升期不断被占领结合。两种受体的平衡对应激反应和行为学适应发挥重要的作用。糖皮质激素通过GR,MR介导的两种反馈模式使HPA轴处于适当的水平。在这个过程中,可以认为皮质醇受体起到了一种转录因子的功能。受体数量,亲和力以及在应激反应中的功能不同,导致不同个体血中皮质醇激素水平的不同,产生不同的生物学行为。目前对PTSD的病人和相关动物模型都观察到了GR,MR的改变。 细胞凋亡(apoptosis),又称程序性细胞死亡(programmed cell death),是由一系列生理和病理刺激引起的。在细胞凋亡的线粒体途径中,主要是细胞色素C从线粒体膜上释放到了胞浆中,导致Caspases级联放大信号系统的激活。细胞色素C进入胞浆中,首先活化Caspase-9, Caspase-9再酶解Caspase-3前体,从而活化Caspase-3,最终引起染色体DNA的降解和细胞的解体。目前已经报道PTSD患者海马体积减小,以及单一连续应激(single prolonged stress, SPS)导致杏仁核神经元的凋亡。Bracha HS对发生PTSD的退伍军人的尸体解剖中发现,蓝斑神经元数目减少,但蓝斑神经元数目减少是否由凋亡引起的呢?PTSD患者蓝斑神经元是否存在凋亡,是否导致了蓝斑功能的异常。 实验方法 1、模型制作及分组 采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的关于大鼠PTSD模型-SPS。其具体方法是将大鼠连续进行下述步骤处理：禁锢2 h；强迫性游泳20min(水深40cm,水温25℃)；休息15min后乙醚麻醉,意识丧失后停止麻醉；无干扰常规喂养直至取材。随机分为6组,对照组、SPS后无干扰地静养1d、4d、7d、14d和28d组。 2、蓝斑GR, MR, Caspase-3免疫组织化学方法 分别选取各组大鼠依次灌流固定、石蜡包埋小脑,制作石蜡切片,分别用SABC法进行蓝斑核的GR, MR, Caspase-3免疫组织化学染色,DAB显色,中性树胶封片,光学显微镜观察,摄片。 3、蓝斑Caspase-9免疫荧光染色方法 石蜡切片用PBS漂洗10min×3,5%BSA封闭20min后,滴加鼠单克隆抗体Caspase-9, 0.01mol/L PBS代替一抗作阴性对照,4℃孵育过夜,滴加FITC标记的羊抗鼠IgG湿盒中37℃孵育30min,甘油封片,荧光显微镜观察并摄片。 4、Western blotting检测蓝斑GR, MR 分别取新鲜蓝斑核经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,提取上清蛋白,电泳,转膜,经封闭后分别加一抗4℃过夜；HRP标记1gG孵育2h,EcL发光,检测条带光密度值。 5、透射电镜技术观察蓝斑神经元线粒体COX的表达变化 切片孵育后用二甲胂酸钠缓冲液漂洗,1% OsO4 4℃固定30-60 min,常规脱水,包埋,经半薄切片、超薄切片厚70μm,JEM1200EX透射电镜下观察。 6、RT-PCR检测蓝斑GR, MR, Caspase-3, Caspase-9和COX 断头取脑分离蓝斑核,提取总RNA,进行逆转录和PCR扩增。扩增结束后进行凝胶电泳,成像并进行积分光密度分析。 结果 1、蓝斑GR, MR, Caspase-3免疫组织化学方法染色的结果 GR分布于神经元的胞核,SPS-1d组、SPS-4d组和SPS-7d组与对照组相比,GR的阳性表达逐渐增强,SPS-14d组与SPS-28d组GR的阳性表达下降。MR分布于神经元的胞体,SPS-1d组与对照组相比,MR的阳性表达明显降低,SPS-4d组、SPS-7d组、SPS-14d组与SPS-28d组MR的阳性表达逐渐增高。 Caspase-3分布于神经元的胞体,SPS-1d组、SPS-4d组和SPS-7d组与对照组相比,Caspases-3的阳性表达逐渐增强；SPS-14d组Caspase-3的阳性表达下降。 2、蓝斑Caspase-9免疫荧光染色方法结果 SPS-1d组、SPS-4d组、SPS-7d组和SPS-14d组Caspase-9阳性反应细胞呈绿色荧光,胞体,胞膜和突起均有着色。 3、Western blotting检测蓝斑GR和MR的结果 GR的分子量87kb,结果显示SPS后1d、4d、7d大鼠蓝斑GR的表达逐渐上调,14d、28d的GR表达恢复性下调。 MR的分子量分别为112kb,结果显示SPS后1d大鼠蓝斑MR急剧下降,SPS-4d、SPS-7d、SPS-14d和SPS-28d的MR表达恢复性上调。 4、透射电镜技术观察蓝斑核神经元线粒体COX的表达变化的结果 对照组蓝斑神经元线粒体形态结构保持良好,阳性产物主要分布在线粒体膜上。SPS刺激后可见线粒体肿胀,空泡变形,嵴断裂,外膜破裂,COX从线粒体内外膜释放到细胞浆中。 5、RT-PCR检测蓝斑GR, MR, Caspase-3, Caspase-9和COX的结果 GR在蓝斑内表达,以β-actin作为内参照,对各组条带进行分析。与正常对照组相比,SPS后1d、4d、7d大鼠蓝斑GR的表达逐渐上调,14d、28d表达恢复性下调。 MR在蓝斑内表达,以(3-actin作为内参照,对各组条带进行分析。与正常对照组相比,SPS后1d蓝斑MR急剧下降,SPS-4d、SPS-7d、SPS-14d和SPS-28d组MR表达恢复性上调。 与正常对照组相比,SPS后1d、4d、7d大鼠蓝斑Caspase-3的表达逐渐上调,14d恢复性下调。COX和Caspase-9于SPS-4d达到顶峰,SPS-7d组和SPS-14d组表达逐渐下降。 结论 1、SPS处理后,蓝斑GR出现短暂上调,随后下调,揭示PTSD大鼠蓝斑神经元核受体GR的表达变化可能导致了PTSD的临床症状。 2、PTSD样大鼠蓝斑神经元MR的表达变化可能直接参与了PTSD持续性精神行为障碍的发生发展过程。 3、蓝斑神经元细胞凋亡可能是导致PTSD患者蓝斑功能失调的重要原因之一。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R749.5
【图文】：

一、免疫组化结果1、GR免疫组化结果高倍镜观察GR分布于蓝斑(图1):免疫组化阳性信号为棕黄色，对照组(图A)GR分布于神经元的胞核;SPS一ld组(图B)、SPS一4d组(图C)与SPS一7d组(图D)与对照组相比，GR的阳性表达逐渐增强，阳性神经元数量也逐渐增多;SPS一14d组(图E)与SPS一28d组(图F)，GR的阳性表达下降，阳性神经元数量也减少，但仍高于对照组(P<0.05)。

2、免疫印迹的结果p一actin和GR的分子量分别为42kb和87kb，结果显示SpS后ld、4d、7d大鼠蓝斑GR的表达逐渐上调，14d、 28dGR表达恢复性下调(图2)。IJ-‘、一卿。少““，，如“一网r‘门”一~一州lr引’”----一叫l4

★均代表相邻两者之间的比较，P<0.05。3、RT一PCR结果p一actin和GR在蓝斑都表达，以p一actin作为内参照(图3)，对各组条带进行分析。与正常对照组相比，SPS后ld、4d、7d大鼠蓝斑GR的表达逐渐上调，14d、28d表达恢复性下调。}…}CDn‘r。‘sPS一“，S一“，s一7‘，s一“‘SPs一28‘}图3，蓝斑GR的RT一PCR平均灰度值及其分析(爪S)。。、.、▲、.、★均代表相邻两者之间的比较

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本文编号：2797638