线粒体MSRB2通过抗氧化应激机制改善阿尔茨海默病样病理改变

发布时间：2020-08-22 00:42

【摘要】：研究目的:蛋氨酸亚砜还原酶B2(Methionine sulfoxide reductase B2,MSRB2)是位于线粒体上的氧化还原酶,具有保护细胞免受氧化应激损伤的作用。MSRB2抗氧化应激的能力提示其可能在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病理生理学改变中起到一定的作用。本研究观察MSRB2在AD小鼠动物模型(APP/PS1)中的表达模式并探讨其与AD样病理改变的关系。研究方法:用Western blot以及免疫组化的方法比较6、18月龄AD和野生型(Wild-type,WT)小鼠的皮质和海马脑组织中MSRB2的表达。在稳定表达人全长?-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)序列的HEK-293细胞中(HEK293 cells stably expressing human full-length APP,HEK/APP)分别转染MSRB2质粒使其过表达、转染MSRB2的短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)使其表达下调后,观察APP代谢通路相关蛋白,Tau蛋白不同磷酸化位点过度磷酸化水平以及相关激酶的变化。用免疫荧光的方法检测MSRB2与线粒体的共定位关系。在细胞中过表达MSRB2后用免疫荧光以及荧光定量酶标仪的方法观察及检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的表达水平。并且在过表达MSRB2后加入过氧化氢(H_2O_2),观察在氧化应激条件下MSRB2是否对APP异常代谢及Tau的过度磷酸化具有改善作用。使用c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及细胞外信号调节激酶(Extracellular signal regulated kinase,ERK)的抑制剂验证其信号通路是否涉及MSRB2参与调节的APP的转录水平。用Western blot验证MSRB2是否具有抗凋亡的作用。研究结果:1.MSRB2的蛋白水平在6月龄及18月龄APP/PS1小鼠的海马中表达降低,只在18月龄APP/PS1小鼠的皮层中降低。2.在过表达MSRB2的HEK/APP细胞中APP和β-淀粉样蛋白转化酶1(β-amyloid converting enzyme 1,BACE1)蛋白及mRNA的水平降低,随之产生的淀粉样蛋白(Amyloid beta peptide,Aβ)1-40以及Aβ1-42的水平降低。3.MSRB2过表达以及敲低对于Tau磷酸化位点和相关的激酶如p-ERK以及磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(Phosphorylation of AMP-activated protein kinase,p-AMPK)具有相反的调节作用。4.免疫荧光证实MSRB2定位于线粒体上,并且过表达MSRB2的细胞内ROS含量显著低于对照组。在用过氧化氢(H_2O_2)处理的细胞中,MSRB2逆转了H_2O_2对APP与Tau磷酸化的影响。5.进一步发现MSRB2调节促进APP表达的信号通路与JNK及ERK有关。6.MSRB2过表达降低凋亡相关蛋白Bax以及caspase3的表达,并且增强抗凋亡相关蛋白Bcl2的表达。研究结论:1.MSRB2在AD的动物模型中表达下降,提示与AD的病理机制密切相关。2.MSRB2是线粒体源性的酶,能够影响Aβ的生成和Tau的异常磷酸化,提示线粒体源性的氧化应激机制在AD的发生发展中起了重要作用。3.MSRB2影响APP和BACE1的表达以及Aβ的产生与JNK有关;而对Tau磷酸化的影响主要与AMPK和ERK信号通路有关。4.鉴于MSRB2逆转了氧化应激下的这些改变,本研究认为抗氧化应激机制是MSRB2的主要作用方式。因此MSRB2也许能为AD治疗方面的研究提供新的方向。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16
【图文】：

图 1.APP/PS1 小鼠脑组织中 MSRB2 蛋白及免疫组化表达水平降低igure1. Cerebral MSRB2 protein and immunoreactivity are decreased in APP/PS1 m(A) Western 印迹法检测及定量野生型(WT)和 APP/PS1 小鼠皮层中的 MSRB2 蛋白对结果进行统计，6 月龄(WT 1.00 ± 0.10, n = 5 vs. APP/PS1 0.99 ± 0.09, n = 5; unpair.108, P = 0.9165)，18 月龄(WT 1.00 ± 0.03, n = 5 vs. APP/PS1 0.72 ± 0.06, n = 5; u t = 4.288, P = 0.0027)。(B)Western 印迹法检测及定量野生型(WT)和 APP/PS1 小鼠SRB2 蛋白表达水平和统计结果，6 月龄(WT 1.00 ± 0.06, n = 5 vs. APP/PS1 0.67 ± 0paired t-test t = 3.010, P = 0.0168)，18 月龄(WT 1.00 ± 0.11, n = 5 vs. APP/PS1 0.40 ±npaired t-test t = 5.579, P = 0.0037)。** p <0.01，*** p <0.001。(C)免疫组织化学染SRB2 特异性抗体对 18 月龄的 WT 及 APP/PS1 小鼠的皮层和海马中 MSRB2 表达测。 与 WT 相比，APP/PS1 小鼠显示出较低水平的 MSRB2 免疫反应性。比例尺=过 Image-pro Plus 6.0 软件对 MSRB2 表达水平进行定量。皮层：WT 1.00 ± 0.05, nPS1 0.44 ± 0.06, n = 4; unpaired t-test t = 7.168, P = 0.0004。海马：WT 1.00 ± 0.15, nPS1 0.45 ± 0.03, n = 4; unpaired t-test t = 3.609, P = 0.0320。

重庆医科大学博士研究生学位论文白表达水平降低，而总 Tau 和 p-Tau231 的蛋白质表达水平没有发生显著进一步探究哪些激酶可能参与影响了 MSRB2 对 Tau 磷酸化的调节，我们表达 MSRB2 的 HEK/APP 细胞中 GSK3β(p-GSK3β)，ERK(p-ERK)，CdPK(p-AMPK)的蛋白激酶表达水平。如图 Fig.3C&D 所示，MSRB2 的过表胞中 p-ERK 和 p-AMPK 的蛋白水平显著降低，而对 p-GSK3β和 p-Cdk5没有显著的影响。与过表达 MSRB2 的结果相反，敲低 MSRB2 显著增u396 和 p-Tau262 的蛋白水平，并且对总 Tau 和 p-Tau231 的蛋白水平未产ig.3E&F)。我们还发现在使用shRNA敲低MSRB2的细胞中，p-ERK和p-A水平显著增加，而 p-GSK3β和 p-Cdk5 蛋白水平仍保持不变(Fig.3G&H)。表明 MSRB2 选择性的影响 Tau 磷酸化位点的磷酸化水平和相关激酶 ERPK 的活性。

图 3. MSRB2 在基础条件下影响 HEK/APP 细胞中的 Tau 磷酸化Figure3. MSRB2 affects Tau phosphorylation in HEK/APP cells under basal condition(A&B) 使用 Western blots 对转染 Vector 或 MSRB2 48 小时的 HEK/APP 细胞中总 Tau，p-Tau396，p-Tau262 和 p-Tau231 的蛋白质水平进行检测以及定量。Total-Tau: Vector 1.00 ± 0.06,n = 6 vs. MSRB2 0.96 ± 0.05, n = 6; unpaired t-test t = 0.564, P = 0.5855. p-Tau396: Vector 1.00 ±0.10, n = 4 vs. MSRB2 0.55 ± 0.07, n = 4; unpaired t-test t = 3.851, P = 0.0085. p-Tau262: Vector1.00 ± 0.09, n = 5 vs. MSRB2 0.55 ± 0.09, n = 5; unpaired t-test t = 3.671, P = 0.0063. p-Tau231:Vector 1.00 ± 0.04, n = 6 vs. MSRB2 1.03 ± 0.04, n = 6; Mann-Whitney test, P = 0.5218。(C&D) 使用Western blots对Vector或MSRB2转染48小时的HEK/APP细胞中p-GSK3β，GSK3β，p-ERK，ERK，Cdk5，p-AMPK 和 AMPK 的蛋白质水平进行检测以及定量。p-GSK3β: Vector 1.00 ± 0.17,n = 4 vs. MSRB2 0.88 ± 0.12, n = 4; unpaired t-test t = 0.559, P = 0.5965. GSK3β: Vector 1.00 ±0.08, n = 6 vs. MSRB2 1.03 ± 0.04, n = 6; unpaired t-test t = -0.309, P = 0.7636. p-ERK: Vector 1.00± 0.07, n = 4 vs. MSRB2 0.69 ± 0.04, n = 4; Mann-Whitney test, P = 0.0210. ERK: Vector 1.00 ±0.07, n = 4 vs. MSRB2 1.11 ± 0.07, n = 4; Mann-Whitney test, P = 0.1490. Cdk5: Vector 1.00 ± 0.06,n = 5 vs. MSRB2 0.84 ± 0.11, n = 5; unpaired t-test t = 1.317, P = 0.2243. p-AMPK: Vector 1.00 ±0.10, n = 6 vs. MSRB2 0.47 ± 0.04, n = 6; unpaired t-test t = 5.086, P = 0.0005. AMPK: Vector 1.0

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