UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-11 08:00

　　微管相关蛋白tau的主要功能是促进微管的组装,维持微管的稳定性。神经元内出现tau蛋白异常聚集体是阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)的主要神经病理学特征之一,且异常聚集的tau蛋白可以引起神经元的退行性改变。细胞内的tau蛋白主要经泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)和自噬-溶酶体通路(autophagy-lysosomal pathway,ALP)清除,这两大系统对底物的选择性降解都与底物的泛素化修饰直接相关。泛素C末端水解酶L1(Ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCH-L1)是去泛素化酶家族的成员之一,它在多聚泛素链的水解和泛素的循环利用过程中发挥重要作用,同时研究发现UCH-L1还具有泛素连接酶的活性,能够产生K63链接的泛素链,而K63链接的泛素链与底物蛋白的靶向结合将促进后者经自噬-溶酶体通路的降解,且该过程与K63和HDAC6的结合并激活HDAC6直接相关。本课题组前期研究也发现,细胞和小鼠海马脑片水平抑制UCH-L1的活性或表达,可引起tau蛋白磷酸化和泛素化修饰异常。但迄今尚无UCH-L1与tau蛋白聚集体清除之间的关系的直接报道。基于以上研究背景,我们拟以稳定转染人tau441异构体的人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293 cells stabling expressing human tau441,HEK293/tau441)为研究对象,探讨UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用,并以K63链接的泛素链和HDAC6为靶标,对其作用机制进行探讨。目的:探究UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用及其分子机制。方法:用蛋白酶体活性抑制剂MG132处理细胞24 hr,然后洗脱含有MG132的培养基加入新鲜的培养基继续培养细胞24 hr,最后在洗脱MG132的同时加入UCH-L1活性抑制剂LDN处理细胞24hr。上述处理结束后,利用免疫荧光技术、免疫印迹技术、免疫沉淀技术、以及HDAC6活性试剂盒检测相关的分子生化指标。结果:(1)MG132处理细胞24hr后,tau蛋白和聚集体形成标志蛋白vimentin向核周聚集形成明显的球状聚集体;洗脱MG132 12 hr后,tau蛋白和vimentin均呈现出分散表达的趋势,球状聚集体逐渐解体;洗脱MG132 24 hr后,核周的球状聚集体消失,tau蛋白和vimentin均匀分布在胞质;洗脱MG132加LDN处理细胞24 hr后,tau蛋白与vimentin在核周共定位,且在核周形成球状聚集体结构。(2)免疫印迹结果显示,与对照组相比,MG132处理组中K63含量增加(P0.01);与MG132处理组相比,MG132洗脱组中K63含量降低(P0.01);与MG132洗脱组相比,MG132洗脱加LDN处理组中,K63含量进一步降低(P0.01)。(3)免疫沉淀结果显示,与对照组相比,MG132处理组中K63与HDAC6的亲和力增加(P0.01);与MG132组相比,MG132洗脱组中K63与HDAC6的亲和力下降(P0.01);与MG132洗脱组相比,洗脱MG132加LDN处理组中,K63与HDAC6的亲和力进一步下降(P0.05)。(4)用活性试剂盒检测HDAC6活性变化结果显示,与对照组相比,MG132组中HDAC6活性上调(P0.01);与MG132组相比,MG132洗脱组中HDAC6活性下调(P0.05);与MG132洗脱组相比,MG132洗脱加LDN处理组中HDAC6活性进一步下调(P0.05)。同时我们也通过免疫印迹技术检测HDAC6作用底物α-tubulin的乙酰化水平以反映HDAC6活性改变情况,发现其结果与试剂盒检测结果一致。(5)免疫荧光双标记结果显示,与洗脱MG132 12hr和24 hr组相比,洗脱MG132的同时加HDAC6活性抑制剂TBSA组中tau蛋白聚集体清除受阻。(6)免疫印迹结果显示,与对照组相比,MG132处理组中自噬活性标记蛋白LC3-II的含量明显升高(P0.01);与MG132组相比,洗脱MG132组中LC3-II的含量降低(P0.01);与洗脱MG132组相比,洗脱MG132加LDN处理组中LC3-II的含量进一步降低(P0.05)。结论:上述结果表明,蛋白酶体活性抑制可以诱导tau蛋白聚集体的形成;UCH-L1活性抑制可通过减少K63泛素链的产生,进而导致HDAC6和自噬活性降低,最终抑制tau蛋白聚集体的清除。
【学位单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

蛋白酶体,泛素,蛋白质

１．１蛋白质质重丨￡制系统逡逑蛋白质是机体细胞的重要组成部分，在细胞的生命活动中行使着重要的功能。逡逑机体细胞中的蛋白质通过不断的合成、降解而处于动态平衡中，这种动态平衡的效维持依赖于细胞中的蛋白质质量控制系统。细胞中主要的蛋白质质量控制系统括泛素－蛋白酶体系统（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｓｙｓｔｅｍ，邋ＵＰＳ邋）和自嗤－溶酶体通（ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｌｙｓｏｓｏｍａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ，邋ＡＬＰ）［】’２］0逡逑１．１．１邋泛素－蛋白酶体系统（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｓｙｓｔｅｍ，邋ＵＰＳ）逡逑ＵＰＳ是ＡＴＰ依赖性的高效特异性蛋白质降解系统，主要降解细胞中异常表达错误折叠的蛋白质，内质网相关的蛋白质以及短周期蛋白质［３］。ＵＰＳ参与细胞内种代谢过程，包括细胞周期的调控，ＤＮＡ的修复，细胞内信号转导，转录，免应答和细胞凋亡等［４＿８］。ＵＰＳ主要包括以下成分：泛素，泛素化酶，２６Ｓ蛋白酶体去泛素化酶等，其具体的作用过程分为两步：（１）底物蛋白的泛素化修饰；（２）素化标记的蛋白质在２６Ｓ蛋白酶体中的降解（图１．１）邋［９］。逡逑Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ逡逑

蛋白酶体,组成成分,泛素,泛素化

．１．１．４逦去泛素化酶（Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，邋ＤＵＢ）逡逑去泛素化酶作为泛素－蛋白酶体系统的重要组成部分，在泛素的循环利用过程中逡逑起重要作用，泛素链在ＤＵＢ的作用下完成去泛素化过程（图１．１）。ＤＵＢ可以通过逡逑移除泛素链与蛋白质之间的连接以及泛素与泛素之间的连接，使泛素单体从蛋白质逡逑

结构示意图,结构域,动力蛋白

组蛋白去乙酷化酶（Ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，邋ＨＤＡＣｓ）是一种核酶，它可以通过移逡逑除蛋白质赖氨酸（Ｋ）残基上共价结合的乙酰基而调节蛋白质的去乙酰化修饰。逡逑ＨＤＡＣ６是ＨＤＡＣｓ家族中的一员，含有５个结构域（图１．３）邋［３４］，分别为Ｎ末端的逡逑核输出信号结构域（Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｅｘｐｏｒｔ邋ｓｉｇｎａｌ，邋ＮＥＳ），去乙酰化酶结构域１邋（Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ逡逑ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｄｏｍａｉｎｌ，ＤＤ１）和去乙酸化酶结构域２（Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｄｏｍａｉｎ２，邋ＤＤ２），逡逑胞质锚定结构域邋ＳＥ１４邋（Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｔｅｔｒａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ邋ｒｅｐｅａｔ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＳＥ１４）和邋Ｃ逡逑末端的泛素－锌指结构域（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｚｉｎｃ邋ｆｉｎｇｅｒ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ＢＵＺ）。Ｎ邋末端的邋ＮＥＳ逡逑结构域使ＨＤＡＣ６从细胞核转运到细胞质中［３５］，而ＳＥ１４结构域则将ＨＤＡＣ６锚定逡逑在细胞质中［３６］，这两个结构域的存在使得ＨＤＡＣ６成为唯一一个可定位于细胞质中逡逑的组蛋白去乙酰化酶。在ＤＤ１和ＤＤ２结构域之间含有动力蛋白结合区结构（ｄｙｎｅｉｎ逡逑ｍｏｔｒｏ邋ｂｉｎｄｉｎｇ，邋ＤＭＢ），该结构能特异性的结合胞质动力蛋白（ｄｙｎｅｉｎ），参与细胞内逡逑依赖于微管的物质运输

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