生物钟蛋白在抑郁症和神经炎症中的机制研究

发布时间：2020-09-14 09:58

　　第一部分AHI1缺失通过生物钟通路下调酪氨酸羟化酶表达造成小鼠抑郁样行为目的:脑内神经递质的减少是抑郁症病人的重要病理特征,而Ahi1(Abelson helper integration site 1)基因敲除(KO)小鼠的五羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)水平明显降低。本研究试图探索AHI1通过何种信号通路参与神经递质调控。方法:通过悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠的抑郁行为。利用q RT-PCR手段去检测5-HT和DA通路中的合成、代谢酶以及相关转运体的m RNA水平。利用免疫组化和免疫荧光的方法观察小鼠中脑腹侧被盖区(VTA)酪氨酸羟化酶(TH)神经元的数目和活性。体外培养Neuro-2a(N2a)细胞系,用RNAi Max转染si RNA敲减Ahi1基因,构建AHI1缺陷细胞模型。用Lipo 2000转染EGFP-AHI1基因,构建AHI1过表达细胞模型。利用q RT-PCR和免疫印迹手段分别去检测相关基因的m RNA和蛋白水平。构建一系列野生型和突变体的报告基因质粒,在过表达AHI1的情况下,检测AHI1对这些基因启动子活性的影响。利用免疫共沉淀的方法,检测AHI1与BMAL1(brain and muscle arnt-like protein 1)的转录因子RORα(retinoid-related orphan receptor-alpha)是否有结合。利用免疫荧光的方法,检测AHI1与RORα是否有共定位。Ahi1 KO鼠中脑立体定位注射REV-ERBα抑制剂SR8278来改善小鼠抑郁。结果:与对照小鼠相比,Ahi1 KO小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间都显著性增加,证明Ahi1 KO小鼠有抑郁表型。通过q RT-PCR和免疫印迹实验发现,Ahi1 KO鼠中TH的m RNA和蛋白水平相比对照鼠显著降低。免疫组化和免疫荧光实验结果表明,Ahi1 KO鼠VTA区域TH神经元数目相比同窝杂合子小鼠无明显改变,而TH神经元活性明显降低。在N2a细胞中分别过表达和敲低Ahi1,通过免疫印迹和QPCR的方法检测蛋白和m RNA的含量,发现AHI1对TH同样有正调控的作用。报告基因实验也显示EGFP-AHI1可以显著性的提高TH启动子的活性。无论在白天还是夜晚,Ahi1 KO鼠TH蛋白的水平都比对照小鼠低。以上结果表明AHI1对TH有正调控作用。REV-ERBα和NURR1对TH有转录调控作用。接下来的研究发现,Ahi1 KO鼠中脑REV-ERBα的蛋白和m RNA水平都显著增加,而NURR1水平没有明显改变。在N2a细胞中敲减Ahi1同样导致REV-ERBα的蛋白及m RNA水平升高。REV-ERBα通过RORE反应元件抑制TH启动子的活性,我们构建了缺失RORE反应元件的TH报告基因质粒(m TH-Luc),发现AHI1对缺失RORE反应元件的TH启动子失去了激活作用。在细胞中敲减REV-ERBα可以显著升高TH的蛋白表达水平。无论在白昼还是夜晚,Ahi1 KO鼠中脑REV-ERBα的蛋白水平都比对照鼠高。EGFP-AHI1可以抑制野生型REV-ERBα启动子的活性以及BMAL1/CLOCK所诱导的REV-ERBα启动子的活性,而不能影响缺失E-Box反应元件REV-ERBα启动子的活性。以上结果表明AHI1对TH的调控是通过负调控REV-ERBα实现的。在Ahi1 KO鼠中脑和Ahi1敲减细胞中,BMAL1的蛋白和m RNA水平均升高,而CLOCK水平无明显改变。免疫共沉淀实验和免疫荧光的实验结果表明AHI1与BMAL1的转录因子RORα有结合。EGFP-AHI1能抑制BMAL1启动子的活性,而如果将BMAL1启动子上的RORα反应元件RORE1和RORE2缺失,EGFP-AHI1就失去了对BMAL1启动子的抑制作用,说明AHI1通过RORα调控BMAL1。在N2a细胞中敲减Bmal1,TH蛋白和m RNA水平都增加,而REV-ERBα的蛋白和m RNA水平都减少。在敲减Bmal1的细胞中,再沉默Ahi1并不能引起REV-ERBα蛋白水平的增加和TH蛋白水平的降低,说明AHI1通过BMAL1调控TH。在细胞中过表达BMAL1/CLOCK,可以明显降低TH启动子的活性,而对缺失REV-ERBα结合位点的TH启动子的活性无明显影响。在Ahi1 KO鼠中脑注射REV-ERBα抑制剂SR8278可以恢复TH神经元的活性,缩短Ahi1 KO鼠在悬尾实验中的不动时间,说明AHI1通过BMAL1/REV-ERBα调控TH。结论:AHI1通过生物钟RORα/BMAL1/REV-ERBα通路调控TH的转录表达从而参与情绪和行为调控。缺失AHI1使BMAL1/REV-ERBα表达增加,因而抑制了TH的表达和DA的合成,这导致了小鼠的抑郁行为。研究结果为临床治疗抑郁症提供了一定的理论和实验依据。第二部分REV-ERBα激动剂通过NF-κB通路抑制小胶质细胞激活目的:REV-ERBα是一种核心钟蛋白,它在维持机体免疫功能中发挥重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统中的一种巨噬细胞,它在神经炎症中发挥重要作用,而神经炎症与抑郁症等许多神经和精神疾病密切相关。然而,REV-ERBα在神经炎症中的作用,及其分子机制目前并不清楚。我们用REV-ERBα的激动剂GSK4112来激活REV-ERBα,从而研究REV-ERBα在神经炎症中的作用。方法:我们使用小胶质细胞系、原代小胶质细胞和动物模型去研究REV-ERBα激动剂GSK4112在体外和体内对小胶质细胞的作用。BV2细胞是一种小鼠来源的小胶质细胞系,先用GSK4112预处理BV2细胞,再用脂多糖(LPS)激活。原代小胶质细胞从新生小鼠皮层提取并准备,处理方法同BV2细胞。GSK4112和LPS通过立体定位装置注射进小鼠中脑。MTT实验用来检测细胞活力。免疫印迹和q RT-PCR实验检测相关基因的表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BV2细胞上清中细胞因子的水平。免疫荧光实验用于检测小胶质细胞和神经元活性,以及p65的分布。核质分离实验用于检测p65的核转位。荧光素酶报告基因实验用于检测GSK4112对基因转录活性的影响。结果:体内和体外实验均证明,REV-ERBα活性升高能消除LPS诱导的小胶质细胞激活。GSK4112预处理BV2细胞能够显著阻断LPS诱导的炎症蛋白的表达以及白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的释放。GSK4112预处理原代小胶质细胞同样能抑制LPS诱导的炎症反应。微定量注射GSK4112到小鼠中脑,能显著减弱LPS诱导的小胶质细胞激活。GSK4112抑制了LPS诱导的NF-κB亚基p65的磷酸化与入核,从而抑制小胶质细胞激活。而且,体内和体外实验都证明了,GSK4112介导的神经炎症抑制保护了神经元免受小胶质细胞诱导的毒性损伤。我们的研究表明,增强的REV-ERBα活性能够抑制小胶质细胞的激活,起到保护神经元的效果。结论:我们的研究表明,药物激活REV-ERBα能够通过NF-κB信号通路抑制LPS诱导的小胶质细胞激活。此外,药物激活REV-ERBα保护了神经元免受LPS介导的损伤,起到了抑制神经炎症的作用。研究结果为临床治疗神经炎症提供了一定的理论和实验依据。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R749.4
【部分图文】：

杂合,行为,强迫游泳实验,神经炎

生物钟蛋白在抑郁症和神经炎症中的机制研究第一部分实验结果1. Ahi1 KO 鼠表现为抑郁样行为之前的研究已经表明 Ahi1 KO 小鼠有抑郁样的行为，多个脑区 DA 和 5-HT 水平均有明显的下降[6, 7]。考虑到 Ahi1 杂合鼠和野生鼠在行为和 AHI1 蛋白表达上均无明显的区别[6, 7]，我们选取 Ahi1 杂合鼠作为对照鼠并调查 Ahi1 KO 鼠的抑郁行为。相比同窝 Ahi1 杂合鼠，Ahi1 KO 鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间都明显增加（图 1A 和 1B），表明 Ahi1 缺失确实会导致小鼠抑郁。

中脑,二氨基联苯胺

40图 2： Ahi1 KO 鼠中脑 TH 的表达。（A）Ahi1 KO 鼠和对照鼠中脑指定基因的mRNA 水平。***P 0.001，**P 0.01，n=5。（B）Ahi1 KO 鼠和对照鼠中脑指定蛋白的水平。**P 0.01，n=5。3. Ahi1 KO 鼠 VTA 区域 TH 荧光强度降低有趣的是，二氨基联苯胺（DAB）的免疫组化结果表明，Ahi1 KO 鼠与同窝 Ahi1

中脑,生物钟,反应元件,核受体

Ahi1KO 鼠与杂合鼠中脑 TH 的蛋白水平在主观黎明（CT00）均高于主观黄昏（CT12）（图5A 和 5B）。而且，不管在 CT00 还是 CT12，Ahi1 KO 鼠 TH 的蛋白水平均显著低于对照鼠（图 5A 和 5B）。总之，我们的结果表明 Ahi1 KO 鼠表现为抑郁样的行为，至少部分是通过降低 TH 的转录表达实现的。图 5： Ahi1 KO 鼠和对照鼠中脑 TH 蛋白的昼夜水平。**P 0.01，n=3。6. Ahi1 KO 鼠中脑 REV-ERBα 表达水平增加生物钟核受体 REV-ERBα 能结合到 TH 启动子的 RRE/NBRE 反应元件上，通过与 TH 的主要转录因子 NURR1 竞争来抑制 TH 的转录[31, 33]。因此，我们检测了敲除Ahi1对NURR1或REV-ERBα的表达是否有影响。我们发现

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