少突胶质细胞NMDA-R在细胞增殖、分化、成髓鞘中的作用及抗精神病药物对其的影响

发布时间：2020-10-10 09:09

　　第一部分NMDA-R阻断对少突胶质细胞增殖、分化及成髓鞘的影响及其可能的机制探讨实验目的:探讨N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体在少突胶质细胞增殖、分化、成髓鞘中的作用及其可能的机制。实验方法:以C57BL/6J小鼠原代少突胶质细胞为研究对象,随机分为对照组和MK-801处理组,运用CCK-8、EdU方法检测细胞增殖情况,运用Western blot技术检测Olig2、MBP蛋白表达以反映细胞分化和成髓鞘作用,运用qRT-PCR检测NMDA-R亚基NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A及NR3B的表达情况。实验结果:CCK-8细胞活力结果显示,NMDA-R阻断剂MK-801呈浓度依赖性减少存活原代少突胶质细胞数量,即随着MK-801浓度增加,存活原代培养少突胶质细胞数量逐渐减少;EdU细胞增殖结果显示,10μmol/L MK-801作用48小时后,原代培养的少突胶质细胞增殖数量(32.9±8.47)%较对照组(42.4±7.35)%明显减少(p=0.0154);Western blot结果显示,与对照组(1.000±0.206)相比,MK-801处理后少突胶质细胞Olig2蛋白表达显著减少(0.794±0.167,p=0.0130.05);MK-801处理后少突胶质细胞MBP蛋白表达也显著减少(1.000±0.276 vs 0.650±0.237,p=0.0260.05);qRT-PCR结果显示,MBP mRNA的表达在MK-801处理后也显著降低(p0.01)。与对照组比较,MK-801处理组少突胶质细胞NMDA-R亚基NR1亚基mRNA表达(1.04±0.29 vs 0.53±0.27,p=0.010.05)及蛋白表达(1.00±0.10 vs0.79±0.17,p=0.0160.05)均显著降低,NR2A(1.00±0.27 vs 0.45±0.19,p=0.0050.05)、NR2B(1.00±0.15 vs 0.55±0.20,p=0.0040.05)及NR3A亚基(1.08±0.15 vs 0.79±0.25,p=0.0380.05)mRNA表达量亦明显降低,但NR2C(p=0.519)、NR2D(p=0.230)、NR3B(p=0.164)mRNA表达水平没有显著性变化。实验结论:NMDA-R阻断剂MK-801对少突胶质细胞的增殖、分化及成髓鞘均具有抑制作用,这种作用可能通过下调NR1、NR2A、NR2B、NR3A亚基来介导。第二部分抗精神病药物通过NMDA-R调控少突胶质细胞增殖及其可能的机制探讨实验目的:探讨抗精神病药物喹硫平、氟哌啶醇和利培酮对少突胶质细胞增殖的影响及其通过改变NMDA-R亚基调控的可能机制,同时探讨抗精神病药物能否逆转NMDA-R阻断引发的细胞增殖减少。实验方法:以C57BL/6J小鼠原代少突胶质细胞为研究对象,随机分为对照组、MK-801组、喹硫平(QUE)处理组、氟哌啶醇(HAL)处理组、利培酮(RIS)处理组及MK-801联合QUE处理组、MK-801联合HAL处理组和MK-801联合RIS处理组,运用CCK-8、Ed U方法检测细胞增殖情况,运用q RT-PCR检测NMDA-R亚基NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A及NR3B的表达情况。实验结果:CCK-8细胞活力结果显示,与对照组相比,三种抗精神病药物QUE、HAL和RIS均能够增加存活原代少突胶质细胞数量;但Ed U结果显示,与对照组Ed U阳性细胞(39.95±9.05)%相比,QUE组Ed U阳性细胞为(46.90±8.47)%,差别不具有显著性;HAL组Ed U阳性细胞为(58.44±10.47)%,显著高于对照组(p=0.0451);RIS组Ed U阳性细胞为(50.41±7.11)%,显著高于对照组(p=0.049)。q RT-PCR结果显示,与对照组相比,QUE处理组中少突胶质细胞NMDA-R的NR1亚基m RNA表达增高(p=0.002),而NR3A的表达降低(p=0.016);HAL处理组中细胞NMDA-R的NR1(p=0.007)、NR2A(p=0.001)、NR2B(p=0.012)和NR2C(p=0.007)m RNA表达增高,NR2D(p=0.025)亚基m RNA表达降低;RIS处理组中少突胶质细胞NMDA-R的NR1(p=0.007)、NR2A(p=0.006)、NR2C(p=0.011)亚基m RNA水平增高;CCK-8结果显示,三种抗精神病药物QUE、HAL均能逆转MK-801对少突胶质细胞增殖的抑制作用。实验结论:单独使用喹硫平对少突胶质细胞增殖无促进作用,但其可逆转MK-801对少突胶质细胞增殖的抑制作用,该作用可能通过调控NR1、NR3A亚基的表达来实现;氟哌啶醇可促进原代培养少突胶质细胞的增殖并可逆转MK-801对少突胶质细胞增殖的抑制作用,该作用可能与上调NR1、NR2A、NR2B、NR2C亚基的表达和下调NR2D亚基相关;RIS虽然不能逆转MK-801对细胞增殖的抑制作用,但其发挥促进细胞增殖作用可能是通过上调NR1、NR2A、NR2C的表达来实现。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R749
【部分图文】：

少突胶质细胞,典型形态,光镜,不同时期

重庆医科大学硕士研究生学位论文料的实验结果以构成比表示。所有实验均独立重复至少 3 次，采用 Graphpism7 软件制图。研究结果1 少突胶质细胞形态学观察细胞培养方法为组织块培养法，培养 48 小时后，可见大部分组织块已贴壁细胞从组织块爬出（如图 2.1，A）。培养 4 天时，可见细胞融合 70%左右，细胞上层有胞体较圆较亮，突起较少的细胞为少突胶质细胞前体细胞（如图 2.；培养 7 天时，OPC 细胞更多，胞体较圆多为单极或双极（如图 2.1，C）细胞传代纯化之后继续培养至 10-12 天，少突胶质细胞突起更多（如图 2.1，DA B

谱系,少突胶质细胞,免疫荧光染色,共表达

重庆医科大学硕士研究生学位论文.2 少突胶质细胞鉴定及纯度为确保细胞培养所获细胞为少突胶质细胞谱系，本实验以细胞形态及免疫标记对少突胶质细胞进行了鉴定。光镜下可见细胞胞体较圆，折光性强，突双极或三极状，为少突胶质细胞典型形态。用少突胶质细胞转录因子oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2）标记少突胶质细胞，DAPI 标记胞核。免疫荧光结果显示（图 2.2），Olig2+细胞占 DAPI+细胞数为（84.2±3.64）胞纯度能够达到实验要求，可用于后续实验检测分析。DAPI Olig2A B

L-谷氨酸,细胞活力,少突胶质细胞,谷氨酸

DAPI nucleus staining(blue), and the merge of both staining, scale bar=50 μm; D:percentage of Olig2-positive cells in cultured system 预先适量 L-谷氨酸对少突胶质细胞的影响查阅文献[42]，少突胶质细胞在体外培养的条件下，由于谷氨酸的不足 NMD无功能状态。因此实验中预先给予 100 μmol/L 谷氨酸，每天刺激少突胶0 分钟，并连续作用至少 3 天。10 μmol/L MK-801 作用 48h 后，CCK-8 检测细胞活力，比较添加谷氨-801 对细胞的作用。结果显示（图 2.3），单独使用 MK-801 时，与对照少突胶质细胞增殖的抑制作用不明显，仅在 100μmol /L 时存活细胞数量（p<0.05）。联合谷氨酸作用，与对照组（0 μmol /L MK-801，100μm酸）相比，细胞活性与 MK-801 浓度成负相关，10-100μmol /L 时抑制作著性差异（*：p<0.05,**:p<0.01)。

【相似文献】