Noggin和BDNF基因修饰的BMSCs、羟基红花黄色素A、重复经颅磁刺激对血管性痴呆大鼠作用机制的研究

发布时间：2020-10-17 02:54

　　 目的：①建立大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的分离、培养及基因转染技术；②筛选BMSCs、Noggin和脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因修饰的BMSCs、羟基红花黄色素A (hydroxysafflor yellow A, HSYA)口重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)等干预血管性痴呆(vascular dementia)大鼠的方法,结合大鼠空间记忆力和海马区血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达分析其效果；③将大鼠海马区长时程增强(long-term potentiation, LTP)与BDNF和N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)不同亚单位的表达结合,分析VaD大鼠空间记忆改善的机理。 方法：①提取大鼠长骨骨髓中的BMSCs,对其进行传代培养,通过MTT等方法计算细胞活力,通过流式细胞技术、成骨诱导和成脂诱导技术对其进行鉴定；②选取第3至第5代的BMSCs进行Noggin和BDNF基因转染,以VVestern blotting(?)勺方法检测BMSCs目的蛋白的表达；③采用2VO法制作VaD大鼠模型,实验动物随机分为正常组、假手术组、模型组、PBS组、生理盐水组、BMSCs组、Noggin修饰BMSCs组、BDNF修饰BMSCs组、HSYA组和rTMS组；④对造模后1周的VaD大鼠分别给予BMSCs移植、转染Noggin的BMSCs移植、转染BDNF的BMSCs移植、HSYA尾静脉注射2周和高频rTMS4周；⑤造模后5周行水迷宫实验检测各组大鼠的空间记忆功能,行LTP实验检测各组大鼠海马区的突触可塑性,以Western blotting的方法检测各组大鼠海马区VEGF、 BDNF、NR1、NR2A和NR2B的表达,以HE染色观察各组大鼠海马区的结构,以免疫组化的方法检测各组大鼠海马区VEGF和NR1的表达。 结果：①通过一般形态学的观察、流式细胞技术、成骨诱导和成脂诱导等鉴定方法显示,贴壁法分离、培养BMSCs可以有效达到纯化的目的；②通过荧光显微镜下观察和Western blotting法检测目的蛋白的表达,显示重组腺病毒Ad-GFP-Noggin和Ad-GFP-BDNF转染BMSCs,可使BMSCs高效表达Noggin和BDNF;③HE染色结果显示2VO法制作血管性痴呆模型,可以模拟人类血管性痴呆的病理表现,而各干预组均可使其病理变化得到改善；④水迷宫结果显不BMSCs移植、Noggin和BDNF转染BMSCs移植、HSYA和rTMS均可改善VaD大鼠的空间记忆功能,且Noggin和BDNF转染BMSCs组优于单纯给予BMSCs组；⑤Western blotting和免疫组化的结果显示,VaD模型组大鼠海马区VEGF表达轻度上调,HSYA和BDNF转染BMSCs可以显著上调VEGF的表达,其余各干预组增加VEGF表达的作用相对较小；⑥LTP结果显示,各干预组均明显优于VaD模型组,以Noggin、BDNF转染BMSCs组和rTMS组为著；⑦Western blotting和免疫组化的结果显示各干预组均可使海马区BDNF、NR1和NR2B的表达上调,以BDNF转染BMSCs组和rTMS组为著,而各组对NR2A均无显著影响。 结论：①贴壁筛选法分离、培养大鼠BMSCs,可获得纯度和活力均较高的BMSCs;②Noggin、BDNF对BMSCs的存活和分化具有重要意义,有望临床应用神经营养因子基因转染BMSCs治疗神经系统疾病；③BDNF基因修饰的BMSCs既能修复受损的记忆功能和突触效能,又可促进血管生成,其总体效果优于单纯的BMSCs移植和Noggin基因修饰的BMSCs移植,对VaD有良好的治疗前景；④HSYA可明显促进血管生成,rTMS可显著调节突触可塑性,有望将二者联合用于临床治疗VaD患者；⑤LTP的形成与BDNF和NMDAR有密切关系,其中NMDAR主要是NR1和NR2B的活化,而不是NR2A; BMSCs、Noggin基因转染BMSCs、BDNF基因转染BMSCs、HSYA和rTMS可能都是通过此途径而改善VaD大鼠的空间学习记忆能力。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R749.1
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
一、大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及Noggin、BDNF基因转染
    1.1 对象和方法
        1.1.1 实验动物
        1.1.2 主要仪器
        1.1.3 主要试剂及耗材
        1.1.4 实验试剂配置方法
        1.1.5 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定
        1.1.6 Noggin、BDNF基因转染BMSCs
        1.1.7 统计学分析
    1.2 结果
        1.2.1 大鼠BMSCs的分离和培养
        1.2.2 大鼠BMSCs的生长曲线
        1.2.3 台盼蓝拒染法测定细胞活力
        1.2.4 大鼠BMSCs的鉴定
        1.2.5 重组腺病毒介导Noggin、BDNF转染BMSCs及转染效率的测定
        1.2.6 Western blotting法检测目的蛋白的表达
    1.3 讨论
        1.3.1 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定方法
        1.3.2 Noggin和BDNF对BMSCs存活和分化的作用
        1.3.3 神经营养因子基因修饰BMSCs治疗神经系统疾病的研究现状
    1.4 小结
二、Noggin、BDNF基因修饰的BMSCs、HSYA和rTMS对VaD大鼠空间记忆和VEGF表达的影响
    2.1 对象和方法
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂及耗材
        2.1.4 实验试剂配置方法
        2.1.5 实验方法
    2.2 结果
        2.2.1 水迷宫实验
        2.2.2 Western blotting检测海马区VEGF的表达
        2.2.3 海马区HE染色
        2.2.4 免疫组化检测海马区VEGF的表达
    2.3 讨论
        2.3.1 血管性痴呆的发病机制及治疗展望
        2.3.2 水迷宫在学习记忆过程研究中的作用
        2.3.3 VEGF促进血管生成和神经保护作用
        2.3.4 BMSCs、Noggin、BDNF、HSYA和rTMS对血管生成的影响
    2.4 小结
三、Noggin、BDNF基因修饰的BMSCs、HSYA和rTMS对VaD大鼠LTP、BDNF和NMDAR的影响
    3.1 对象和方法
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 主要试剂及耗材
        3.1.3 实验试剂配置方法
        3.1.4 实验方法
    3.2 结果
        3.2.1 海马CA3-CA1区LTP
        3.2.2 Western blotting检测相关蛋白的表达
        3.2.3 免疫组化检测相关蛋白的表达
    3.3 讨论
        3.3.1 LTP的形成机制及其在探讨突触可塑性中的作用
        3.3.2 NMDAR在学习记忆过程中的作用
        3.3.3 BDNF、Noggin与LTP和NMDAR的关系
        3.3.4 HSYA的神经保护作用
        3.3.5 rTMS对学习记忆过程的调节
    3.4 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述 骨髓间充质干细胞和神经营养因子治疗血管性痴呆的研究进展
    综述参考文献
致谢

【参考文献】

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本文编号：2844161