抗Aβ单抗绕过血脑屏障进入小鼠大脑海马区有效途径研究

发布时间：2020-10-24 13:08

　　 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是中枢神经系统一种常见的神经退行性疾病,其典型的病理学特征包括：淀粉样斑块(即老年斑Senior Plaque, SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经突触减少或神经元丢失。β—淀粉样多肽(β-amyloid peptide, A β)被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质。大量动物试验研究表明,针对Aβ的免疫疗法可以有效减少APP转基因鼠脑内聚集的Aβ纤维,而且能够明显改善AD模型鼠的认知状况。抗Aβ抗体研究为AD治疗提供了新思路,可能成为AD治疗的新途径。但是抗Aβ单克隆抗体要发挥作用需要进入AD病变部位以清除Aβ斑块。但是血脑屏障的存在阻止了其从血液循环进入脑实质,使其应用潜力受到限制。探索研究大分子蛋白药物如何穿过或绕过血脑屏障到大脑中枢系统发挥更有效作用是当前面临的一个很大挑战和迫切需要解决的难题。 目前临床上治疗中枢疾病的大分子药多采用静脉、腹腔方式给药,但是进入大脑实质真正发挥药效的药物的极少。虽然脑室或脑实质内注射可使药物有效作用于大脑病变部位,但其具有创伤性且可能造成感染、出血等并发症,因此难以在临床工作中广泛展开。 近年来鼻腔给药引起了临床研究者越来越多的关注。研究发现鼻腔给药可以避开血脑屏障经嗅觉通路进入脑内,避免腹腔或静脉注射途径中经血液循环入脑而引起的全身副作用,且所需药物剂量低、吸收迅速无首过效应、给药方便等。但是鼻腔给药也有缺点,就是主要靠被动渗透作用进入脑内,因此效率仍比较低,而且对分子量较小的物质效果更好,而对于分子量较大的抗Aβ单克隆抗体效率较差。 近年来研究发现霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin B subunit, CB)能与神经细胞膜表面的神经节苷脂(GMl)配体特异结合,经嗅神经细胞轴浆转运至大脑内。其受体配体结合主动转运的特性使得鼻腔给药后转运的效率大大提高。 因此,本课题采用将抗Aβ单克隆抗体与CB偶联,之后将偶联物采用鼻腔给药方式。研究抗Aβ单抗绕过血脑屏障进入大脑海马部位的效率及改善情况,为老年性痴呆(AD)的免疫治疗探索更有效途径。 实验内容主要包括：一、抗Aβ1-42单克隆抗体制备及鉴定；二、抗Aβ单克隆抗体与CB偶联方法及效率研究；三、偶联物(CB-IgG)经鼻给药进入大脑的效率研究;四、抗体经鼻给药进入APP模型鼠脑内后与Aβ斑块结合的研究。 一.抗Aβ142单克隆抗体制备及其性质鉴定 抗A β单克隆抗体的杂交瘤细胞经培养增殖、接种小鼠腹腔,腹水用酶联免疫吸附试验(Elisa)检测抗Aβ单克隆抗体的效价。用ProteinA亲和层析法分离纯化抗Aβ单克隆抗体。SDS-PAGE电泳、Western Blot分析鉴定单抗的纯度及亚型。最终得到了IgG型抗Aβ1-42的单抗,其腹水效价达1：1×106,经Protein A亲和层析柱纯化抗体,纯度可达90%以上。经与病变脑组织切片免疫组化染色证实,该抗体具体很好的生物学活性,可以用于后续动物实验。 二.抗A β1-42单克隆抗体与CB偶联方法及标记效率研究 运用CB能与神经细胞膜表面的神经节苷脂(GM1)配体特异结合,经嗅神经细胞轴浆转运至大脑内的载体特性,分别采用戊二醛法及改良的过碘酸钠法,将CB与抗Aβ单抗偶联和效率比较。结果显示戊二醛法偶联后在160KD及180KD出现新的蛋白条带,可能为戊二醛形成的多聚体,其偶联率约为10%。而过碘酸钠法偶联后在75KD出现新的蛋白条带,该条带为抗Aβ单抗轻链与CB结合,其偶联率约为总IgG量的20%。因此我们最后采用改良的过碘酸钠法。其标记率较高,偶联物各成分活性保持的较好。 三.CB-IgG绕过血脑屏障进入小鼠大脑的效率研究 CB-IgG组及各对照组分别经小鼠鼻腔给药,用Western半定量分析、免疫组化及MRI方法检测单抗进入小鼠大脑部位的量及效率比较。 检测结果为：CB-IgG组有60%的IgG进入大脑中,IgG组有12%进入大脑,CB-IgG组较IgG组效率高5倍。免疫组织化学检测显示IgG主要进入齿状回的颗粒细胞和CA1区的椎体细胞,在齿状回CB-IgG组阳性细胞为IgG组的5倍(P0.01),在CA1区CB-IgG组阳性细胞较少,CB-IgG组阳性细胞为IgG组的3倍。磁共振弥散张量成像分析显示,CB-IgG组较IgG组对大脑区产生的影响更明显(P0.01)。 CB-IgG偶联物鼻腔给药可以绕过血脑屏障将更多抗Aβ单抗进入脑内海马部位,其效率比单用IgG提高了5倍,为研究老年性痴呆免疫治疗的更有效途径提供了新的思路。 四、抗体鼻腔进入APP模型鼠脑内后与斑块结合的研究 用核磁共振成像技术检测模型鼠与正常鼠脑DTI参数相比,FA值增大,且两者之间有显著差异(P0.05)。间接说明APP鼠大脑内斑块沉积、神经元变性坏死等一系列变化。 免疫组化方法检测显示：APP模型鼠淀粉样沉积主要集中在大脑内海马区齿状回及齿状回邻近的大脑皮层(嗅球-海马区)。而鼻腔注射抗体一周后,免疫组化染色可见到抗体进入脑内在海马区及邻近的大脑皮层(嗅球-海马区)阳性染色。而对照组免疫组化未见阳性染色。说明抗体鼻腔进入APP模型鼠大脑后可以与脑内的Aβ淀粉样斑块结合。 结论：将CB用改良的过碘酸钠法与单抗偶联,偶联效率为20%；鼻腔给药后CB-IgG偶联物可以绕过血脑屏障将更多抗Ap单抗带入脑内海马部位,其效率比单用IgG提高了约5倍；给APP模型鼠鼻腔注射抗体一周后,可见到抗体进入脑内在海马区及邻近的大脑皮层(嗅球-海马区)与淀粉样斑块结合。为研究AD免疫治疗的更有效途径提供了新的思路。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R749.16
【文章目录】：
目录
摘要
Abstract
缩略词表
前言
实验材料
实验方案
    一、抗Aβ1-42单克隆抗体制备及鉴定
    二、抗Aβ单克隆抗体与CB偶联方法及效率比较
    三、偶联物（CB-IgG）经鼻给药进入大脑的效率比较
    四、抗体经鼻给药进入APP模型鼠脑内后与Aβ斑块结合
实验结果
    一、抗Aβ1-42单克隆抗体制备及鉴定结果
    二、抗Aβ单克隆抗体与CB偶联方法及效率结果
    三、偶联物（CB-IgG）经鼻给药进入大脑的效率结果
    四、抗体经鼻给药进入APP模型鼠脑内后与Aβ斑块结合结果
讨论
小结
参考文献
附录
个人简历
致谢

【参考文献】

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1 杨志勇,汪华侨,徐杰,谢瑶,黄绍宽,袁群芳,成林平,姚志彬;阿尔茨海默病人外周血中抗淀粉样蛋白抗体的特性[J];解剖学研究;2005年02期

2 张卿;刘雁勇;白丽敏;石葛明;万选才;孙红梅;左萍萍;;霍乱毒素B亚单位-神经生长因子耦联制剂滴鼻对拟痴呆小鼠空间学习记忆的影响[J];中国康复理论与实践;2010年04期

本文编号：2854507