GLP-1类似物对AD样神经退行性变的保护作用及其机制

发布时间：2020-10-25 19:13

　　 目的:GLP-1类似物对阿尔茨海默病样神经退行性变的神经保护作用及其相关机制。方法:1)采用处于对数生长期的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y共成6组:空白对照组即CON组,磷酸盐缓冲液PBS处理12h;模型组即wortmannin干预组,1μmol/L wortmannin处理12h;药物对照组即杜拉鲁肽(D)或GLP-1(7-37)短肽(P)干预组,10nmol/L杜拉鲁肽或50nmol/L GLP-1(7-37)短肽处理12h;治疗组即D+W或P+W组,分别由10nmol/L杜拉鲁肽与1μmol/L wortmannin共同处理12h或50nmol/L GLP-1(7-37)短肽与1μmol/L wortmannin共同处理12h;共同干预组即D+W+E组或P+W+E组,分别由10nmol/L杜拉鲁肽、1μmol/L wortmannin与10μmol/L Ex9-39共同干预12h或50nmol/L GLP-1(7-37)短肽、1μmol/L wortmannin与10μmol/L Ex9-39共同干预12h;抑制剂组即E组,10μmol/L Ex9-39处理12h。MTT法检测各组细胞活力,蛋白免疫印迹法检测各组微管相关的Tau总蛋白、不同磷酸化位点蛋白质,神经丝NFs磷酸化水平,胰岛素信号通路PI3K-GSK3β和MAPK中关键酶的磷酸化水平。细胞免疫荧光检测GLP-1信号的改变。2)取SPF级6周龄20只雄性野生型C57BL/6(WT)小鼠和40只APP/PS1/Tau三重转基因(Tg)小鼠随机地分成4组:野生组即WT组,野生型小鼠鼻腔给予生理盐水治疗;野生滴鼻GLP-1(7-37)组即WT+Du组,野生型小鼠鼻腔给予GLP-1(7-37)短肽治疗;转基因组即Tg组,转基因小鼠鼻腔给予生理盐水治疗;转基因给药组即Tg+Du(N)组、Tg+Du(P)组和Tg+Ins(N)组,转基因小鼠分别鼻腔给予GLP-1(7-37)短肽、皮下注射GLP-1(7-37)短肽和鼻腔给予胰岛素混悬液。其中Tg+Du(P)组和Tg+Ins(N)组作为Tg+Du(N)组的阳性对照。各组小鼠每天早晚2次给药,总共给予10μg GLP-1(7-37)短肽和0.4单位胰岛素,WT组和Tg组则每天给予等体积的无菌生理盐水,持续4周。每天监测各组小鼠体重和血糖改变情况;Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力;蛋白免疫印迹法检测小鼠脑组织中Tau蛋白和神经丝蛋白(NFs)的磷酸化水平,胰岛素下游信号通路PI3K-GSK3β以及MAPK关键酶的磷酸化水平。结果:1)与CON组细胞相比,模型组和抑制剂组细胞活力下降,Tau蛋白在丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)262、396和404位点以及NF-H/M的磷酸化水平升高,而杜拉鲁肽和GLP-1(7-37)组处理的细胞活力上升,Tau各位点和NFs蛋白的磷酸化水平降低;与模型组的细胞相比,杜拉鲁肽和GLP-1(7-37)治疗后细胞活力上升,Tau各位点和NFs蛋白的磷酸化水平下降。但与治疗组细胞相比,经过Ex9-39共同干预后的细胞活力下降,Tau各位点和NFs蛋白磷酸化水平增高。与CON组细胞相比,模型组和抑制剂组细胞PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平和突触蛋白水平降低,而杜拉鲁肽和GLP-1(7-37)治疗后细胞PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平和突触蛋白水平升高;与模型组细胞相比,杜拉鲁肽和GLP-1(7-37)处理的细胞PI3K-GSK3β和MAPK蛋白表达水平上升,经过Ex9-39干预后,其蛋白磷酸化表达水平下降。2)除胰岛素组外,各组小鼠体重和血糖变化无差异。与野生组小鼠相比,转基因小鼠逃避潜伏期和游泳路径长度明显延长,穿越隐匿平台次数和目标象限游泳时间显著缩短,小鼠脑内Tau和NFs蛋白磷酸化修饰明显增多,胰岛素信号通路PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平显著降低。而转基因小鼠鼻腔给予GLP-1(7-37)短肽或胰岛素,皮下给予GLP-1(7-37)短肽后转基因小鼠逃避潜伏期和游泳路径长度明显缩短,穿越隐匿平台次数和目标象限游泳时间显著缩短,小鼠脑内Tau和NFs蛋白磷酸化修饰明显减少,胰岛素信号通路PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平显著升高。结论:1)GLP-1类似物杜拉鲁肽和GLP-1(7-37)短肽改善细胞活力,增加突触蛋白表达,减少Tau和NFs过度磷酸化的神经保护作用可能与胰岛素和GLP-1信号水平激活有关;2)GLP-1(7-37)短肽鼻腔给药提高AD小鼠认知、学习和记忆能力,降低小鼠脑内Tau和NFs过度磷酸化的神经保护作用可能与改善小鼠脑内胰岛素信号有关。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

操作步骤：人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y 贴壁生长于75ml培温箱中孵育，完全培养基培养，隔 3 天更换一次培养液。时，冻存、传代或用于实验。1.1.2.2 药物的量效曲线和实验分组（1）药物的量效曲线测定：①杜拉鲁肽设定浓度与时间梯度：分别设置 0.5nmol/L、25nmol/L 和 50nmol/L 浓度梯度，分别作用于 0h、3h、6h②GLP-1(7-37)短肽设定浓度与时间梯度：分别设置 50500nmol/L、1μmol/L 和 3μmol/L 浓度梯度，分别作用于 ③wortmannin 设定浓度与时间梯度：wortmannin 分别设置和 10μmol/L 浓度梯度，分别作用于 0h、3h、6h、9h 和 ④Ex9-39 设定浓度与时间梯度：Ex9-39 分别设置 2μmol/L8μmol/L 和 10μmol/L 浓度梯度，分别作用于 0h、3h、6

天津医科大学硕士学位论文 二、GLP-1（7-37）短肽对 AD 小鼠的保护作用及其机制图 2 各药物浓度的量效曲线A.：杜拉鲁肽的量效曲线；B：GLP-1(7-37)短肽的量效曲线；C：wortmannin 的量效曲线；D：Ex9-39 的量效曲线。（n=10）1.2.2 各组细胞活力分析采用 MTT 实验探究各组细胞的活力的变化及各药物对细胞活力的影响。与CON 组细胞相比，W 组和 E 组细胞活力下降（P＜0.05），D 组与 P 组细胞活力上升（P＜0.05）；与 W 组细胞相比，D+W 组与 P+W 组细胞活力上升（P＜0.05）；分别与 D+W 组或 P+W 组细胞相比，对应 D+W+E 组或 P+W+E 组细胞活力下降（P＜0.05）。A B

图 4 各组细胞 Tau 蛋白磷酸化水平的 Western blot 结果A：Tau 蛋白磷酸化水平的 Western blot 结果；B：杜拉鲁肽处理的 Tau 蛋白各磷酸化位点定量分析统计图；C：GLP-1（7-37）短肽 处理的 Tau 蛋白各磷酸化位点定量分析统计图与 CON 组细胞比较，*P＜0.05，与 W 组细胞比较，#P＜0.05，与 D+W 或 P+W组比较，ΔP＜0.05。（n=3）1.2.4 NF-H/M 磷酸化水平比较R61d 抗体检测细胞内 NFs 总 NF-H 重链和 NF-M 轻链蛋白变化，SMI31 抗体检测细胞 NF-H 重链和 NF-M 轻链蛋白磷酸化水平。结果显示，各组 NFs 未被磷酸化的总蛋白无明显差异。与 CON 组细胞相比，W 组和 E 组细胞 NF-H/M磷酸化水平升高（P＜0.05），D 组和 P 组细胞 NF-H/M 磷酸化水平下降（P＜0.05）；与 W 组细胞相比，D+W 组和 P+W 组细胞 NF-H/M 磷酸化水平下降（P＜0.05）；与 D+W 组或 P+W 组细胞相比，D+W+E 组或 P+W+E 组细胞 NF-H/M 磷酸化水
【参考文献】

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本文编号：2855845