基于质谱技术的阿尔兹海默症小鼠脑组织中标志物的定量技术研究

发布时间：2020-11-13 13:41

　　 阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease,AD)是影响全球数百万人并与年龄有关的神经性疾病。其主要的病理标志特征是β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉积和tau蛋白的过磷酸化,分别形成细胞外斑块和细胞内神经原纤维缠结。这个过程的许多机制细节仍然是未知的,但蛋白质聚集的一个确定结果是阿尔茨海默症脑中的突触功能障碍和神经元损失,包括线粒体功能障碍,氧化应激,炎症和金属代谢在内的不同途径都被认为与这一过程有关。金属离子如铜,锌和铁在健康和疾病状态的大脑中均发挥重要作用,并且金属离子在体内含量和分布的变化是不同神经退行性疾病和衰老的共同特征。阿尔茨海默症标志性蛋白和其中的金属结合性质可能是病理生理过程中重要的生物化学基础。本文建立了一种基于稳定同位素标记的对脑组织中Aβ蛋白进行绝对定量的方法。测量生物样品中低丰度的Aβ1-40是阿尔茨海默症研究中一个有意义的指标。以13C标记的Aβ1--40蛋白为内标,利用Aβ1-40蛋白三种抗体M3.2、4G8、11A50B的共同作用进行免疫沉淀,酸性(pH=2)70℃加热条件下洗脱,并与基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)联用,Aβ1-40蛋白标准品回收率可达到48.7%。利用该方法和ELISA试剂盒法分别测定小鼠脑组织匀浆上清中Aβ1-40的含量,两者没有显著性差异(p0.1),该方法特异性好,并且操作简单,重复性、准确度好,更适用于市面上没有对应ELISA试剂盒的蛋白。本文还建立了 ID-ICP-MS方法,测定小鼠脑组织的皮层、海马、丘脑及其他脑区中的铁、铜、锌三种元素含量,并对检测限、定量限、精密度、重复性、准确度进行方法学验证。结果显示,相比于对照鼠,模型组鼠脑中铁、铜、锌在不同脑区中的含量有明显差异。铜、锌元素主要沉积在小鼠海马、皮层脑区,而铁元素主要沉积在小鼠海马区域。利用ELISA方法测定模型组与对照组小鼠不同脑区中的蛋白含量,以探究与阿尔兹海默症有关的蛋白和金属间的关系。结果表明,Aβ1-40蛋白、Aβ1-42蛋白、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)、tau蛋白均是海马、皮层中的含量较高,且模型组含量高于对照组,这与铁、铜、锌在各脑区中的分布很类似。而金属硫蛋白-3(Metallothionein-3,MT-3)在模型组小鼠各脑区中含量均低于对照组,且各脑区中含量差异不大。通过查阅文献,对所得的各蛋白和金属间的关系进行了机理方面的解释。本文新建立了两种方法分别定量小鼠脑组织中的蛋白和小鼠各脑区中的金属元素,并且探究了小鼠各脑区中蛋白与金属间的关系,为探索阿尔兹海默症中的金属与蛋白间的关系提供了参考,也为疾病标志物的定量研究开辟了新思路。
【学位单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R749.16
【部分图文】：

ａｓｍａ?ｍｅｍｒａｎｅ??图１－１?ＡＰＰ酶切生成Ａｐ蛋白示意图??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＡＰＰ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｔｏ?ｇｅｎｅｒａｔｅ?Ａｐ?ｐｒｏｔｅｉｎ．??过程中突触正常功能的受损、丧失可能与痴呆相关，或对疾病进。密集的斑块沉积导致周围的神经突弯曲并改变轨迹，这可导

而形成带上电荷的离子。此电离仪是适合测定生物大分子的软电离方式。飞行时间质??谱仪可通过检测生物大分子离子的质荷比，得出生物大分子的分子量信息并对生物大??分子结构进行剖析，如下图１－２所示。??ＭＡＬＤＩ?Ｌｉｎｅａｒ?ＴＯＦ??幽?Ｉ?Ｉ??“?＾?４?ｙ?ＤＥＴＥＣＴＯＲ??Ｉ?Ｈｅａｖｙ?ｉｏｎｓ?Ｌｉｇｈｔ?ｉｏｎｓ?Ｉ??１?０?ＩＩ?丨?Ｐｅｐｔｉｄｅｓ??７Ｈｉｇｈ?ｖｏｌｔａｇｅ?Ｍａｔｒｉｘ??图１－２?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ原理示意图??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ??ＭＡＬＤＩ分析过程中，通常情况下先将样品（纯品或混合物）和基质的溶液预先??混合，并将２？５?ｐＬ混合溶液直接点到样品板上，要选择适当的基体使其在激光器的??发射波长处具有大的消光系数。通常使溶剂在室温和压力下蒸发以产生不均匀的结晶??表面。在质谱仪内部，激光脉冲到晶体表面，基质立即升华，同时分析物分子发生解??吸和电离。然后测量分析物离子的ｍ／ｚ值。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ质谱谱图是ｙ轴上的信号强??度图和ｘ轴上对应的质量／电荷值。强度等级是离子的相对丰度，但是通常低于约ｍ／ｚ??５００的区域没有被显示，因为它被基质离子的信号饱和。纯化合物的ＭＡＬＤＩ谱图通??常以质子化分子的单电荷离子形式

完成绝对定量需要加入内标，选择ｎＣ稳定同位素标记的Ａ（３Ｍ〇蛋白作为内标。免疫??沉淀－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ定量蛋白原理图??如下图１－３所示。??Ｃ?＾?Ｃ?、??Ｘ?二?％咏?＾??ｓ???＼?＜?＾?＼?ｓ＇?＾??Ｓ－?＾??加入同位索内标?加入抗联后的??＿织勾架丨？？髓?富集Ｈ标蛋白??，?来?ｊ、?ｊ??震?同位索内标?＾??＾?ＭＡＬＤＩ检测?麟分离及洗涤过程??图１－３免疫沉淀－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ定量蛋白原理图??Ｆｉｇ．?１－３?Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ?－?ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ?ＭＳ??１．３?ＩＤ－ＩＣＰ＿ＭＳ测量各脑区中的金属元素??１．３．１阿尔兹海默症小鼠各脑区中金属元素的分布??金属离子在大脑中起着重要的作用，并且在不同的神经退行性疾病中也是指向其??稳态功能障碍的有力证据，包括第一排过渡金属，铁，铜和锌以及钙等，其稳态对于??神经功能和老化过程都很重要口］。事实上，与年龄相关的金属离子功能障碍改变了??ＡＤ脑内有关区域中金属离子的水平，包括在蛋白质沉积物中的累积。金属离子与ＡＤ??病理蛋白之间的相互作用表明蛋白质错误折叠、聚集与金属离子稳态之间具有密切关??系。在ＡＤ患者中
【共引文献】

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本文编号：2882256