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硫胺素缺乏对β-淀粉样多肽前体蛋白加工和Aβ生成的作用及机制研究

发布时间:2020-11-15 22:35
   阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年痴呆的最常见类型,其神经病理学特征主要表现为沉积在细胞外的老年斑(Senile plaques,SPs)和细胞内聚集的神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)以及区域性的神经元丧失。目前,对于AD的发病原因及其病理机制了解甚少,尚没有有效的治疗方法。β-淀粉样多肽(β-Amyloid peptide,Aβ)是SPs的主要成分,来源于β-淀粉样多肽前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的蛋白剪切。大量研究表明Aβ的代谢异常可能是AD起始性的病理环节。研究Aβ的代谢对于探讨AD的发病机理较为重要。 硫胺素(Thiamine)即维生素B_1,是人体必需的营养成分。硫胺素在体内主要以焦磷酸硫胺素(Thiamine pyrophosphate,TPP)的形式存在,TPP是糖代谢途径中的丙酮酸脱氢酶复合体,α-酮戊二酸脱氢酶复合体以及磷酸戊糖途径中的转酮醇的辅酶因子。硫胺素在维持脑内氧化代谢平衡方面也发挥了重要作用。硫胺素缺乏(Thiamine deficiency,TD)会导致以上三种酶类的活性下降、三羧酸循环发生障碍、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)产生受阻。此外,硫胺素缺乏过程中产生了大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),导致了氧化应激的发生。主要依靠糖代谢提供能量的神经组织对硫胺素缺乏高度敏感,硫胺素缺乏的中枢神经表现称为脑型维生素B_1缺乏症,也称韦尼克—科尔萨科夫综合症(Wernicke-Korsakoff's syndrome,WKS),病人除了有明显的认知丧失、记忆力减退外,晚期WKS病人出现脑室扩大,神经元死亡。其脑内的KGDHC活性也明显降低。在硫胺素缺乏动物模型上,硫胺素缺乏处理的小鼠脑内出现了神经元死亡,小胶质细胞、星型胶质细胞肥大、增生等神经退行性疾病的共同病理表现。此外,研究显示,在AD病人中,TPP含量和TPP依赖型的酶类的活性都有明显的下降,表明硫胺素缺乏可能在AD病理中起了一定的作用。但硫胺素缺乏在AD中的具体作用尚未得到系统的研究。 我们在体外培养的稳定转染了瑞典型突变APP基因(APPsw)的人源神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)上和C57BL/6J小鼠上成功诱导了TD模型,并通过酶连免疫吸附实验、免疫印迹实验、免疫组织化学等技术手段系统地研究了TD对APP加工(APP processing)的影响以及其可能的机制。 首先,在APPsw SH-SY5Y细胞上,TD处理5天导致了大约13.5%的细胞死亡,发生凋亡的细胞增加了2倍。MTT法检测表明TD处理5天导致细胞活力下降了大约50%。第二,酶连免疫吸附实验测定Aβ的结果显示:TD处理显著增加细胞外和细胞内的Aβ的含量。与对照组(胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分别是5.52±0.12和0.66±0.23 pg/ml·mg)相比,TD5天组胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分别上升到18.57±2.31和3.85±0.52pg/ml·mg;细胞内的Aβ_(40)和Aβ_(42)分别从对照组的23.4±5.1 7和7.06±1.03 pg/mg分别上升到86.03±8.19和23.52±1.02 pg/mg。第三,免疫印迹实验显示在TD过程中,细胞中成熟形式的APP蛋白水平降低,不成熟形式的APP蛋白水平没有明显变化。说明在TD过程中APP的表达水平没有增加,应该不是导致Aβ积累的原因。第四,酶活力测定的结果表明负责APP加工的β-分泌酶的活性在TD过程中明显增高,而γ-分泌酶的活性在这一过程中没有显著性变化。前人研究结果证实β-site APP cleaving enzyme 1(BACEl)具有β-分泌酶的活性,我们分别从转录以及翻译水平研究了BACE1基因的表达情况,发现在TD处理过程中,BACE1基因的mRNA水平没有明显变化,BACE1的蛋白总量也没有明显改变。然而,与对照组相比,BACE1蛋白的成熟形式增加了大约2倍,而不成熟形式的BACE1降低了大约50%。表明β-分泌酶的活性调节不是通过增加BACE1基因的转录水平或翻译水平,而是通过促进BACE1蛋白的翻译后修饰(BACE1蛋白的成熟过程)来实现的。为了进一步确定β-分泌酶的活性在TD过程中明显增高,我们检测了TD过程中β-分泌酶产物:β-C terminalfragment(β-CTF)的变化,免疫印迹结果显示β-CTF含量在TD过程中明显增高。第五,TD处理5天后,补充硫胺素24小时明显地减弱了BACE1蛋白的成熟过程,下调β-分泌酶的活性,降低了Aβ的积累。表明补充硫胺素对TD引起的Aβ的积累具有一定的补救作用。第六,在TD处理5天时,向培养液中添加β-分泌酶抑制剂24小时可以抑制Aβ和β-CTF的积累。第七,TD增加了细胞内活性氧的积累,抗氧化剂Trolox不仅可以降低TD导致的细胞内活性氧的积累,也抑制了BACE1蛋白的成熟过程和Aβ的积累。表明氧化应激可能是TD引起Aβ积累的内在机制。最后,在TD处理过程中,添加低浓度(250pmol/L)的化学合成的Aβ到培养液里明显加剧了TD导致的氧化应激。表明Aβ的积累增强了TD引发的氧化应激。 以上的离体实验结果在TD小鼠模型上得到了验证:(1)TD处理9天或更长时间会导致丘脑区域的丘脑中线旁丘脑核(Submedial thalamic nucleus,SmTN)出现明显的神经元死亡;(2)在TD小鼠丘脑区域,Aβ_(40)和Aβ_(42)含量显著增加:对照组和TD10天组的Aβ_(40)分别是0.97±0.15和3.34±0.33 pmol/g;Aβ_(42)分别是0.16±0.01和0.49±0.02 pmol/g;(3)TD处理8天后补充硫胺素可以减少丘脑区域Aβ_(42)的积累。 综上,我们的实验结果表明:(1)由TD引起的氧化应激导致了APP蛋白加工过程中产生了更多的Aβ;(2)氧化应激的作用靶点是BACE1蛋白。进一步,TD对β-分泌酶的活性调节是通过促进BACE1蛋白的翻译后修饰(BACE1蛋白的成熟过程)来实现的;(3)Aβ的积累也加剧了TD导致的氧化应激。提示氧化应激和Aβ的积累之间存在着正反馈的效应。 本工作发现硫胺素缺乏引起的氧化应激促进了APP加工中产生更多的Aβ,Aβ的积累反过来加剧了硫胺素缺乏导致的氧化应激。氧化应激和Aβ的积累之间存在着正反馈的效应。这一效应很可能参与了AD的发生、发展。最后,体外、体内补充硫胺素实验都表明及时补充硫胺素可以缓解硫胺素缺乏对APP加工的影响,表明对于出现硫胺素缺乏相关症状的AD病人,考虑及时补充硫胺素是有益的。
【学位单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2008
【中图分类】:R749.16
【部分图文】:

示意图,淀粉样,前体蛋白


图2.p一淀粉样多肤前体蛋白(Amyloidpreeursorprotein,App)加上(APPproeessing)过程示意图。A即是一次跨膜的膜蛋白,N端的胞外部分可以被a一分泌酶或p一分泌酶切断,产生了游离的多肤片段A即sa或者APPsp,剩余的c端片断仍然留在膜上,因其所含的氨基酸个数而被称为C83片段或者C99片段,也称a一cTF或p一cTF。通过膜上的竹分泌酶的进步剪切,C83片段被切成P3和APPintraeellula:domain(Aleo);e99片段则被切成p一amyloidpeptide(Ap)和AICD(该图片改画白FrankM.LaFerla,2005)。其正常的生理功能[l1一13]。在AD病人的脑组织中,构象发生了改变的Ap聚集并沉积在胞外,与变性的神经突起一起构成了SPS,在SPs的周围常常有激活的胶质细胞【14,15]。Ap假说是目前最广为接受的关于AD的假说,Ap假说认为Ap的积累是导致AD的初始的和最重要的原因【16]。目一前己知常染色体上的三个基因的突变会导致家族型的阿尔茨海默病(familia:Alzheime:disease,FAD),分别是21号染色体上的App基因[17]、14号染色体上的早老素l(presenilinl,Psl)基因[18、19]和l号染色体上的早老素2(presenilinZ,psZ)基因【20」。Psl或PsZ基因表达的蛋白与其它3种蛋白组成了Y一分泌酶复合体,负责产生Ap的

照片,硫胺素,细胞增殖


图3.硫胺素(Thiaminedefieieney,TD)缺乏对砂pswsH一sv5y细胞增殖、死亡的影响。A.四种培养条件下细胞的增殖、死亡情况。10倍物镜下拍摄明场照片。B,MTT法检测细胞活力的结果,以对照组(Ctrl)为100%。C.AnnexinV+PI双染色的流式细胞仪分析结果。较大字体的数值代表AnnexinV阳性细胞的百分比,小字体的数值为Pl阳性细胞的百分数。ctrl:完全培养液对照组;Ctri+Py:完全培养液加pyrithiamine组;TDM:硫胺素缺乏培养液组;TDM+即硫胺素缺乏培养液加pyrithiamine组。0day指接种细胞24小时后,更换培养液后这一时间点。(*P<0.05and**P<0.01)综合上面三个实验的结果,我们得出以下结论:严重的TD会导致APPswSH一SYSY细胞死亡,在本实验中,我们未观察到TD对细胞增殖产生明显影响。此外,单纯添加30onmol几的硫胺素拮抗剂pyrithiamine对细胞没有产生明显致死作用。因此,在接下来的体外细胞实验中,我们选择了添加pyrithiaminc的TD处理,并将添加300nmol/Lpyrithiamine的处理最长时间点设定在5天;对照组只采用普通的DMEM培养液处理。在这样的条件下,细胞仅有轻微的死亡发生,可以最大限度避免因细胞死亡过程中固有的变化被误认为是由TD处理导致的特

硫胺素缺乏对β-淀粉样多肽前体蛋白加工和Aβ生成的作用及机制研究


TD导致Ap的积累
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