补肾活血汤石油醚通过miR-539靶向Wnt5a促进MSCs体外迁移的实验研究

发布时间：2020-11-16 18:20

　　 目的:MSCs的归巢在骨折损伤修复中发挥重要的作用,非编码微小RNA(miRNA)在MSCs归巢中的作用仍未明确。既往研究表明补肾活血汤的石油醚提取物能有效促进MSCs体外迁移。本研究通过补肾活血汤石油醚提取物干预MSCs,筛选差异性表达miRNA并以此为切入点,阐明补肾活血汤石油醚提取物促进MSCs迁移过程中的关键miRNA在MSCs迁移的作用,为中医药治疗骨折提供新策略和药理靶点。方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠MSCs,通过细胞表面抗原流式细胞仪检测P3代MSCs,并鉴定其成脂和成骨分化潜能。利用CCK-8法检测补肾活血汤石油醚提取物对MSCs增殖的影响。Transwell实验观察补肾活血汤石油醚提取物对MSCs细胞迁移的影响,qRT-PCR检测检测补肾活血汤石油醚提取物对Wnt5a及JNK、PKC、CaMKII的mRNA表达的影响。并通过siRNA沉默Wnt5a观察对MSCs迁移的影响。接着利用miRNA高通量测序技术筛选补肾活血汤石油醚提取物干预MSCs后差异表达的miRNA,结合qRT-PCR验证筛选出差异表达的miRNA。利用miRNA mimic和inhibitor转染MSCs后行Transwell实验和划痕实验对miRNA的功能进行验证。利用生物信息学预测软件进行靶基因预测、进行双荧光素酶报告基因实验和Western blot检测确定miRNA调控的靶基因。结果:流式细胞学检测细结果显示所培养P3代细胞高表达CD90和CD44(表达率97.44%和96.55%),低表达CD45和CD34(表达率0.14%和0.21%)。并且成功诱导形成骨细胞及脂肪细胞,符合干细胞的特性。CCK-8实验结果显示,各浓度组(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)补肾活血汤石油醚干预都能促进MSCs增殖。Transwell实验表明各浓度组(1μg/ml、10μg/ml和10Cμg/ml)补肾活血汤石油醚处理后明显促进MSCs迁移,其中补肾活血汤石油醚促进迁移的最佳浓度是10μg/ml。qRT-PCR结果显示各浓度组(1μg/ml、10μg/ml 和 100μg/ml)补肾活血汤石油醚均能促进Wnt5a及 JNK、PKC、CaMKII mRNA的表达。转染siRNA沉默Wnt5a后,MSCs迁移能力明显下降。miRNA高通量测序筛选出补肾活血汤石油醚干预后差异倍数大于2的miRNA有70个,其中高表达miRNA有27条,低表达miRNA有43条。对12条差异表达较大的且与细胞迁移相关的miRNA进行qRT-PCR验证,发现miR-539呈现低表达。Transwell实验和划痕实验显示过表miR-539能抑制MSCs迁移,低表达miR-539能促进MSCs迁移。靶基因预测和双荧光素报告基因检查发现Wnt5a为miR-539的调控靶点。Western blot检测结果显示过表达miR-539能抑制Wnt5a蛋白表达。结论:补肾活血汤石油醚提取物能有效促进MSCs增殖。补肾活血汤石油醚提取物能有效促进MSCs迁移,其作用机制可能通过下调miR-539,靶向Wnt5a信号通路所实现。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5

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本文编号：2886517