β淀粉样蛋白基因表达载体的构建及转化

发布时间：2021-05-17 03:58

　　β淀粉样蛋白（amyloidβpeptide,Aβ）是治疗阿尔兹海默氏病的关键靶标之一。目前免疫治疗使用的免疫原Aβ主要通过化学方法合成,生产成本高且免疫性弱,不能满足科研和医疗对免疫原的需求。基因工程技术为高免疫性Aβ的大量生物合成提供了有效途径。本文构建了Aβ串联基因的真核及原核表达载体,研究了Aβ基因在大肠杆菌的表达并获得了转基因烟草,为利用基因工程技术生产Aβ疫苗奠定了基础。本实验依据人类Aβ基因序列及重叠PCR技术原理设计引物,通过PCR扩增获得2个Aβ基因串联的DNA片段（2Aβ）;将此片段克隆到载体pGEX-6P-1（GST）中,构建了原核表达载体pGEX-6P-1-Aβ;将此载体转化大肠杆菌BL21并进行蛋白诱导表达;利用GST抗体进行的Western杂交检测结果显示,GST/Aβ融合蛋白能在大肠杆菌中表达,但表达量低而且有降解。为提高外源基因在植物中的表达水平,本实验构建了含双CaMV35S启动子及TEV增强子的植物表达载体pBIDST（d35S-tev/gus）;转基因烟草的GUS组织化学染色结果初步表明,d35S-tev驱动的gus基因的表达水平高于CaMV35S... 

【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 阿尔茨海默病简介
    1.2 Aβ在阿尔茨海默病中的作用
        1.2.1 Aβ的分子结构特征及产生
        1.2.2 Aβ的神经毒性
        1.2.3 Aβ与炎症反应
    1.3 以Aβ为靶标治疗阿尔茨海默病的研究进展
        1.3.1 抑制Aβ产生和沉积
        1.3.2 抗氧化作用
        1.3.3 抗炎症治疗
        1.3.4 Aβ免疫治疗
    1.4 转基因植物疫苗的研究进展
        1.4.1 转基因植物疫苗的特点
        1.4.2 转基因植物疫苗存在的问题及解决方案
        1.4.3 Aβ植物疫苗的研究现状
    1.5 本研究的目的和意义
2 β淀粉样蛋白基因原核表达载体的构建及表达
    2.1 实验材料和试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒DNA的小量提取
        2.2.2 重叠PCR法克隆Aβ串联基因
        2.2.3 原核表达载体pGEX-6P-1-Aβ的构建
        2.2.4 Aβ串联基因在E.coli BL21中的诱导表达及检测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 2Aβ基因片段的克隆
        2.3.2 原核表达载体pGEX-6P-1-Aβ的构建
        2.3.3 2Aβ蛋白表达
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 含双35S启动子和TEV增强子的植物表达载体的构建
    3.1 实验材料和试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 载体pBIDST的构建
        3.2.2 工程菌的获得
        3.2.3 农杆菌介导的叶盘转化
        3.2.4 转化植株的PCR检测
        3.2.5 GUS组织化学染色
    3.3 结果与分析
        3.3.1 载体pBIDST的构建
        3.3.2 转基因抗性烟草的获得
        3.3.3 转基因烟草的分子检测
        3.3.4 转基因植株GUS组织化学染色检测
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 Aβ基因植物表达载体的构建及转化
    4.1 实验材料和试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 2Aβ基因植物表达载体的构建
        4.2.2 烟草转化及抗性芽筛选
        4.2.3 抗性植株PCR检测
        4.2.4 烟草叶片RNA提取
        4.2.5 抗性植株RT-PCR检测
    4.3 结果与分析
        4.3.1 2Aβ基因植物表达载体的构建
        4.3.2 转基因烟草的获得
        4.3.3 转基因烟草的PCR检测
        4.3.4 转基因烟草的RT-PCR检测
    4.4 讨论
    4.5 小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]β淀粉样蛋白致神经细胞凋亡机制的研究进展[J]. 张书刚,张颖冬.  中国临床神经科学. 2008(03)
[2]乙肝表面抗原基因表达载体的构建及对百脉根的转化[J]. 贺红霞,林春晶,王铭,董英山.  农业生物技术学报. 2007(01)
[3]乙型肝炎表面抗原基因转化花生及其表达[J]. 朱剑光,尉亚辉,郭芝光,吴艺舟,郝浩永,孙杰.  植物学通报. 2006(06)
[4]胡黄连糖甙对拟痴呆模型小鼠的神经保护作用[J]. 李婷,刘建文,曹艳,张小东,魏东芝,卢艳花.  华东理工大学学报(自然科学版). 2006(05)
[5]植物基因工程疫苗研究进展[J]. 刘科,尉亚辉.  药物生物技术. 2006(01)
[6]Protective Effect of Ecdysterone on PC12Cells Cytotoxicity Induced by Beta-amyloid25-35[J]. 杨素芬,吴忠均,杨正钦,吴芹,龚其海,周岐新,石京山.  Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 2005(04)
[7]Aβ1-15多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果[J]. 张革,汪华侨,邹俊涛,李国营,袁群芳,林贤,姚志彬.  中山大学学报(医学科学版). 2005(04)
[8]银杏叶提取物干预Aβ1-42 β-折叠形成及其分子机制[J]. 李光武,汪华侨,姚志彬.  中风与神经疾病杂志. 2004(04)
[9]阿尔茨海默氏病及其药物治疗研究进展[J]. 朱杰,张学景,邹永.  广州化学. 2004(02)
[10]融合基因Aβ-HBcAg的原核表达及表达蛋白的免疫反应性和免疫原性分析[J]. 胡海涛,冯改丰,董炜疆,王全颖.  西安交通大学学报(医学版). 2004(03)



本文编号：3191025