抗β-淀粉样蛋白鼠源融合抗体在Pichia pastoris中的表达、纯化及性质研究

发布时间：2021-11-21 09:07

　　阿尔茨海默病（AD）是一种以记忆和认知功能障碍为主要症状的中枢神经系统变性疾病，是老年痴呆的常见类型。由于AD病因还不是很清楚，目前国内外还没有疗效好而无副作用的特效药物问世。但是有很多遗传学和生物化学证据表明，在大脑中相互聚集的Aβ是发病过程中的关键物质。动物试验揭示，无论是主动免疫还是被动免疫均能有效减少转基因鼠脑内主要由Aβ相互聚集形成的纤维构成的淀粉样变的量，并且逆转记忆损伤。因此，针对Aβ的免疫治疗将是一种非常有前景的治疗AD的方法。 本课题方案是根据Aβ分子的结构特点，设计两种可识别Aβ纤维的多肽序列，与人IgG抗体的Fc段重组，构成人源化的融合抗体，并应用酵母表达体系表达制备。该抗体具有类似天然抗Aβ抗体诱导巨噬细胞清除斑块的功能，并且由于其Fc段为人源，不会引起人体的炎症反应，对AD的研究和治疗具有潜在的理论和应用价值。为了鉴定这种融合抗体是否能够在体内发挥作用，我们需要表达制备含有小鼠Fc段的融合抗体，并将抗体注射入转基因小鼠（APP695）体内，观察该融合抗体在体内的作用效果。 前期工作中，我们已经构建了含有目的基因的单拷贝表达载体PAO815AFc。经... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

PUC19质粒图谱

一、鼠源融合抗体表达载体的鉴定1.1含有目的基因的PUC19质粒酶切鉴定图鉴定连接入PUC19载体中的目的基因的正确性(图1一)l。由于目的基因两端具有EocRI酶切位点，所以可以根据酶切下来的片段大小来判断载体中的目的基因是否正确。PUC19空载体约为269kb，连入目的基因(约Ikb)后，其分子量变为3.69kb。故用EocRI酶切后可以得到.27kb和Ikb两条带。1AIFe一PUC19质粒(3.69kb)2AIFe一PUC19质粒EeoRI3分子量标准DL150004AZFe一PUC19质粒(3.69kb)5AZFe一PUC19质粒EeoRI酶切(2.7kb，Ikb)酶切(2.7kb，Ikb)﹄Pb()﹄﹄粼25001000250图1一1EcoRI酶切鉴定质粒载体PUC19中的日的基因1.2PUC19质粒载体测序结果:对克隆入融合基因的PUC19一A:Fc和PUC19一AZFc进行测序，结果正确。姗姗砒森至}磕笙扮、扮蔗、八巍妞\、_、八扑嵌窟瓜八、{袱众…淤痴心孩、，与仅苏天了冤二诬韶

图l一2一ZPUC19一ZFeDNA测序结果图1.3含有目的基因的PAOS巧质粒酶切鉴定鉴定连接入PAOS巧载体中的目的基因的正确性(图1一3)。PAOS巧空载体约为7.7kb，由于a因子前导肤序列第23个bp和pAos15载体第6858bp处各有一个pstl位点，所以带有AapFc基因的EocRI酶切片段，正向连入PAOS巧后应能切出一1.SKb的Pstl片断;若为反向连接，Pstl片断的长度为.2SKb，所以可以根据酶切下来的片段大小来判断载体中的目的基因是否正确。结果显示从PA0815载体中切出的片段为1.SKb，证明目的基因插入正确。12345Marker仁bP)1AIF。一PAO815质粒(9.skb)ZA:Fe一PAOS15质粒(9.skb)3分子量标准DL150004A，F。一PA0815质粒Pstl酶切(7.7kb


本文编号：3509206