突变型Tau蛋白对自身纤维化及微管组装功能的影响

发布时间：2022-09-30 13:49

　　额颞叶痴呆（FTD）是继阿尔茨海默病之后,第二大常见的痴呆症。部分FTD具有与17号染色体连锁关系,命名为FTDP-17。FTDP-17是位于染色体17q21.31上的MAPT基因突变所致。至今,在家族性额颞叶痴呆病例中,已陆续发现MAPT基因中大约有80个致病性错义突变,大多落在Tau蛋白结合微管的编码区。Tau蛋白是微管相关蛋白,在神经元细胞内主要协助微管组装,但病变的Tau蛋白却会从微管上脱落,异常聚集,形成诱导神经元死亡的病理产物。目前,在阿尔茨海默病中Tau蛋白研究热点主要集中于过度磷酸导致的相关病理机制,而很少涉及Tau蛋白的基因突变。有报道称,FTDP-17中的Tau基因突变同样可形成类似于阿尔茨海默症患者大脑中发现的神经纤维缠结（NFT）。所以,从Tau蛋白基因突变入手,特别是微管结合区域的突变,研究不同突变对Tau蛋白纤维化和微管组装功能的影响是一条新的途径。本研究课题选取的是FTDP-17临床上已发现的5种Tau突变:K257T、N279K、P301L、K317M和V337M,它们位于Tau结合微管的重复区域（R1-R4）。以Tau k18片段为材料,首先通过对Ta... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 Tau蛋白相关的神经退行性疾病
        1.1.1 Tau蛋白与阿尔茨海默症
        1.1.2 Tau蛋白与FTDP-
        1.1.3 其他Tau蛋白相关疾病
    1.2 Tau蛋白
        1.2.1 Tau蛋白的结构
        1.2.2 Tau蛋白的生理功能
        1.2.3 Tau蛋白的异常修饰
        1.2.4 基因突变对Tau蛋白功能的影响
    1.3 Tau蛋白的纤维化研究
        1.3.1 Tau蛋白的纤维化过程
        1.3.2 Tau蛋白纤维的核心结构
        1.3.3 肝素与Tau蛋白的纤维化
    1.4 微管蛋白与微管的组装
        1.4.1 Tubulin的结构
        1.4.2 微管的组装
        1.4.3 Tau蛋白与Tubulin的相互作用
    1.5 分子模拟技术的应用及研究进展
        1.5.1 分子模拟技术的简介
        1.5.2 分子模拟在生命科学研究中的应用
    1.6 本工作的研究目的和主要研究内容
        1.6.1 研究目的及意义
        1.6.2 研究内容
第二章 Tau蛋白基因定点突变及表达纯化
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器
        2.1.4 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 Tau蛋白基因的定点突变
        2.2.2 Tau突变型质粒的扩增与鉴定
        2.2.3 目的基因的转导与菌体的保种
        2.2.4 Tauk18蛋白的表达
        2.2.5 Tauk18蛋白的纯化
    2.3 实验结果及分析
        2.3.1 PCR定点突变的结果
        2.3.2 表达条件探索结果
        2.3.3 样品不同前处理方法比较
        2.3.4 HPLC法对蛋白纯化的结果
    2.4 讨论
第三章 突变型Tau蛋白对自身纤维化的影响
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 蛋白
        3.1.2 试剂
        3.1.3 仪器
        3.1.4 试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 Tau蛋白自身纤维化模型的构建
        3.2.2 不同突变型Tau蛋白自身纤维化动力学比较
        3.2.3 Tauk18蛋白纤维化产物的电泳鉴别
        3.2.4 透射电镜观察不同突变型Tau蛋白纤维的结构
        3.2.5 不同pH值对Tauk18自身纤维化的影响
        3.2.6 DTT对Tau蛋白自身纤维化的影响
    3.3 实验结果及分析
        3.3.1 不同浓度的肝素钠对Tauk18自身纤维化的动力学影响
        3.3.2 Tauk18蛋白BCA定量结果
        3.3.3 不同突变型Tauk18蛋白纤维化动力学比较结果
        3.3.4 取样不同Tauk18蛋白单体与纤维的电泳结果
        3.3.5 透射电镜拍摄不同突变型Tauk18蛋白纤维的结果
        3.3.6 不同pH值对Tauk18自身纤维化的影响
        3.3.7 DTT对Tau蛋白自身纤维化的影响
    3.4 讨论
第四章 突变型Tau蛋白对微管组装动力学的影响
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 蛋白
        4.1.2 试剂
        4.1.3 仪器
        4.1.4 试剂配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 微管组装模型的建立
        4.2.2 不同突变型Tauk18蛋白对微管组装动力学的影响
        4.2.3 电泳鉴别微管组装反应产物
    4.3 实验结果及分析
        4.3.1 微管组装模型的建立
        4.3.2 不同突变型Tauk18蛋白对微管组装动力学影响
        4.3.3 电泳鉴别微管组装反应产物
    4.4 讨论
第五章 Tau蛋白与Tubulin结合的分子动力学模拟
    5.1 材料与仪器
        5.1.1 模拟体系
        5.1.2 分子动力学模拟运行的服务器
    5.2 实验方法
        5.2.1 Tauk18同源建模
        5.2.2 Tubulin同源建模
        5.2.3 Tauk18与Tubulin的分子对接与分子动力学模拟
        5.2.4 Tauk18与Tubulin结合的自由能计算
    5.3 实验结果及分析
        5.3.1 Tauk18同源建模的结果
        5.3.2 Tubulin同源建模的结果
        5.3.3 Tauk18与Tubulin分子对接的模型
        5.3.4 Tauk18与Tubulin的结合自由能
        5.3.5 Tubulin-Tau(K257T)复合物的分子动力学模拟
        5.3.6 Tubulin-Tau(N279K)复合物的分子动力学模拟
        5.3.7 Tubulin-Tau(P301L)复合物的分子动力学模拟
        5.3.8 Tubulin-Tau(K317M)复合物的分子动力学模拟
        5.3.9 Tubulin-Tau(V337M)复合物的分子动力学模拟
    5.4 讨论
结论
参考文献
附录A Tauk18及突变型的氨基酸序列
附录B Tubulin单体的氨基酸序列
致谢
攻读硕士学位期间研究成果



本文编号：3683665