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吗啡耐受依赖的蛋白磷酸化机制研究

发布时间:2022-10-30 14:23
  阿片类物质(如吗啡、海洛因等)具有强大的镇痛效应,但极易产生耐受和依赖,而且戒断症状非常严重,这不仅极大地限制了其临床应用,而且其滥用和依赖也严重危害社会安定。本研究的目的在于探讨吗啡耐受依赖的细胞分子机制,以求在众多环节中为阿片类物质耐受依赖的防治寻找新的突破。为此,建立小鼠吗啡耐受依赖动物模型及SH-SY5Y神经细胞类吗啡依赖样细胞模型。从细胞信息传递入手,观察吗啡耐受依赖动物小脑、纹状体、海马及大脑皮层及SH-SY5Y细胞中一些信使物质、蛋白激酶PKA及PKC活性变化及其对信息传导通路中的一些关键酶AC、NOS、sGC、PDE等酶的活性及转录因子c-Fos的磷酸化调节,研究吗啡耐受依赖中的蛋白磷酸化机制。本实验的主要结果如下: 1.小鼠吗啡耐受依赖模型的建立:小鼠每日递增剂量皮下注射(s.c.)吗啡7天,给药至第4天吗啡镇痛作用已不明显;末次给药后2h,s.c.注射纳洛酮可诱发小鼠戒断症状,跳跃反应发生率达100%,体重明显下降,出现腹泻、睑下垂、双后肢站立、自发活动增加等。表明递增给药可建立小鼠吗啡耐受依赖模型。 2.... 

【文章页数】:124 页

【学位级别】:博士

【文章目录】:
缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
实验材料
    1 实验动物
    2 实验药品与试剂
    3 主要仪器及设备
实验方法
    1 小鼠脑室埋管及药物引入
    2 小鼠吗啡耐受依赖动物模型的建立
        2.1 吗啡的给药方式
        2.2 光辐射热甩尾潜伏期测定(TFL)
        2.3 纳洛酮诱发戒断症状的观察
    3 人成神经瘤细胞SH-SY5Y吗啡依赖样模型的建立
        3.1 SH-SY5Y细胞培养及分化
        3.2 吗啡作用不同时间及纳洛酮激发后cAMP水平的测定
    4 吗啡耐受依赖小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞cAMP含量测定
        4.1 cAMP提取
        4.2 cAMP含量测定
        4.3 cAMP含量计算
    5 吗啡耐受依赖小鼠脑组织AC活性的测定
        5.1 AC提取
        5.2 AC活性测定
    6 吗啡耐受依赖小鼠脑组织cGMP含量测定
        6.1 cGMP提取
        6.2 cGMP含量测定
        6.3 cGMP含量计算
    7 吗啡耐受依赖小鼠脑组织sGC活性测定
        7.1 sGC提取
        7.2 sGC活性测定
    8 吗啡耐受依赖小鼠脑组织PDE活性测定
        8.1 PDE样品制备
        8.2 PDE活性测定
    9 吗啡耐受依赖小鼠脑组织cNOS和iNOS活性测定
        9.1 NOS样品制备
        9.2 NOS活性测定
        9.3 NOS活性计算
    10 吗啡耐受依赖小鼠脑组织磷酸肌醇含量测定
        10.1 脑组织~3H-肌醇的掺入及磷酸肌醇(IP、IP_2、IP_3)含量测定
        10.2 磷酸肌醇含量计算
    11 吗啡耐受依赖小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞PKA活性测定
        11.1 PKA样品制备
        11.2 PKA活性测定
        11.3 PKA活性计算
    12 吗啡耐受依赖小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞PKC活性测定
        12.1 PKC样品制备
        12.2 PKC活性测定
        12.3 PKC活性计算
    13 吗啡耐受依赖小鼠脑组织AC、sGC、PDE、NOS反磷酸化测定
        13.1 磷酸化反应
        13.2 SDS-PAGE及放射自显影分析
    14 吗啡依赖样SH-SY5Y细胞c-Fos磷酸化测定
        14.1 细胞c-Fos ~(32)P放射性标记
        14.2 细胞裂解
        14.3 抗原-抗体复合物形成
        14.4 靶蛋白c-Fos的免疫沉淀
        14.5 免疫沉淀物中放射性标记蛋白SDS-PAGE及放射自显影分析
    15 蛋白质浓度测定
    16 数据处理
实验结果
    1 小鼠吗啡耐受依赖模型的建立
        1.1 小鼠对吗啡镇痛效应的耐受
        1.2 小鼠形成吗啡依赖过程中体重的变化及纳洛酮诱发吗啡依赖小鼠的戒断反应
    2 吗啡耐受依赖小鼠脑组织cAMP、cGMP、磷酸肌醇(IP、IP_2、IP_3)含量的变化
        2.1 cAMP含量变化
        2.2 cGMP含量变化及NOS抑制剂对其影响
        2.3 磷酸肌醇含量变化
    3 吗啡耐受依赖小鼠脑组织PKA及PKC活性变化及PKA、PKC抑制剂对小鼠吗啡耐受依赖形成的影响
    4 i.c.v.PKA及PKC抑制剂、NOS抑制剂脑组织病理形态学检查
    5 PKA、PKC对吗啡耐受依赖小鼠脑组织AC活性的磷酸化调节
        5.1 吗啡耐受依赖小鼠脑组织AC活性的变化及PKA、PKC抑制剂对其影响
        5.2 PKA对AC的磷酸化作用
    6 PKA、PKC对吗啡耐受依赖小鼠脑组织sGC活性的磷酸化调节
        6.1 吗啡耐受依赖小鼠脑组织sGC活性的变化及PKA、PKC抑制剂对其影响
        6.2 PKA对sGC的磷酸化作用
    7 PKA、PKC对吗啡耐受依赖小鼠脑组织NOS活性的磷酸化调节
        7.1 吗啡耐受依赖小鼠脑组织NOS活性的变化及PKA、PKC抑制剂对其影响
        7.2 PKA对NOS的磷酸化作用
    8 PKA、PKC对吗啡耐受依赖小鼠脑组织PDE活性的磷酸化调节
        8.1 吗啡耐受依赖小鼠脑组织PDE活性的变化及PKA、PKC抑制剂对其影响
        8.2 PKA对PDE的磷酸化作用
    9 吗啡依赖样SH-SY5Y细胞模型的建立及纳洛酮诱发的类阿片戒断现象
    10 SH-SY5Y细胞形成阿片依赖样过程中PKA、PKC活性变化
    11 PKA、PKC对吗啡依赖样SH-SY5Y细胞c-Fos磷酸化的调节
讨论
    1 吗啡耐受依赖的实验模型
    2 阿片受体耦联的第二信使系统的适应性变化与吗啡耐受依赖
    3 胞内信使调节的蛋白激酶PKA及PKC与吗啡耐受依赖
    4 吗啡耐受依赖的蛋白磷酸化机制
    5 以蛋白磷酸化为中心的多种信号系统的相互作用与吗啡耐受依赖
结论
参考文献
文献综述 蛋白磷酸化与信号转导机制
致谢


【参考文献】:
期刊论文
[1]吗啡长时程作用对小鼠脑组织蛋白激酶A及C活性的影响[J]. 方芳,陈轶琨,王小明,刘景生.  基础医学与临床. 1997(02)
[2]正常与肾性高血压大鼠不同血管平滑肌磷酸肌醇含量的研究[J]. 周立平,路涛,文允镒,黄文欣,张淑芳,陈孟勤.  中国应用生理学杂志. 1995(01)
[3]阿片和阿片样物质耐受及成瘾的生化基础[J]. 李思嘉,汤健,韩济生.  生理科学. 1982(03)



本文编号:3699055

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