BACE1特异DNA适配子的筛选及其抑制BACE1作用的初步研究

发布时间：2017-07-18 17:35

  本文关键词：BACE1特异DNA适配子的筛选及其抑制BACE1作用的初步研究

  更多相关文章： 指数富集的配基系统进化 DNA适配子 淀粉样蛋白 β-淀粉样前体蛋白裂解酶1抑制剂

【摘要】：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease, AD)是一种渐进性的中枢神经系统退行性疾病,以认知功能障碍尤其是记忆恶化为主要临床表现。晚期病人生活不能自理,给患者家庭及社会带来巨大的经济负担。由于人口老龄化和诊断率提高,AD患者的发病人数逐年增加,已成为日益严重的医疗保健问题。目前AD的发病机制尚不清楚,临床上也尚无根治方法。当前常用的药物乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂只能用于对症治疗。淀粉样斑块(amyloid plaques)是AD的主要病理学特征,其主要由淀粉样蛋白(amyloid β, Aβ)组成。Ap是导致AD发病的重要因素。Ap由p-分泌酶及γ-分泌酶依次水解淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)产生。由于γ-分泌酶有多个不同水解位点,可产生多种不同氨基酸长度的Ap肽。其中Aβ40、Aβ42是两种主要的Ap单体。各种Ap单体和它们组成的低聚物、纤维状物在脑内异常聚集、沉积,引起神经毒性。预防和减少过多的Ap产生是AD治疗中的主要策略。p-淀粉样前体蛋白裂解酶1 (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1, BACE1),也称β-分泌酶1 (β-secretase 1),是最主要的p-分泌酶,是Ap产生过程中的限速酶。抑制BACE1的表达或活性将从根本上减少Ap产生。已发现在AD病人尸检脑组织中,BACE1的表达和活性增高。在有前驱症状的AD病人脑脊液中BACE1的水平也出现增高的现象。在具有APP Swedish突变基因(APPsw)的病人中,APP对BACE1的结合亲和力增加,因而导致Ap产量增加。临近BACE1水解位点的APP基因中的一个编码突变(A673T)可减少BACE1对APP的裂解,具有预防AD的作用,为阻断BACE1水解APP可对抗AD的理论提供了进一步的证据。一些研究也有力地证明了抑制BACE1活性可减轻小鼠脑内的Aβ负荷。因此BACE1是治疗AD的良好靶标。目前,BACE1抑制剂的开发面临诸多挑战,尚没有安全有效的BACE1抑制剂应用于临床。适配子(aptamer)是能形成特定的三维空间结构的寡核苷酸(单链DNA或RNA分子),能以高亲和力和高特异性结合靶分子。与传统的抗体相比,适配子有如下特征：分子量小,可在体外快速且重复合成,易于化学修饰；稳定性好便于长期储存；毒性低,免疫原性小；快速良好的组织渗透性。这些优点使得适配子可代替抗体作为分子探针在基础研究和临床应用中发挥作用。适配子可通过指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术筛选得到。SELEX技术筛选步骤主要包括：首先将体外构建的库容量约为1013-1015的随机寡核苷酸文库与靶分子孵育；然后分离寡核苷酸-靶标复合物与未结合的寡核苷酸；再进行PCR扩增结合的寡核苷酸序列。经过数轮或数十轮重复筛选,逐渐富集到特异结合靶分子的寡核苷酸序列。纯化蛋白质是最常用的SELEX筛选的靶标。以蛋白质为靶标筛选出的适配子,可高效特异地抑制靶蛋白及用于核酸-蛋白质作用机制的研究。本研究利用SELEX技术,以纯化的人BACE1蛋白胞外段作为靶分子,从体外合成的含30个核苷酸(nucleotides, nt)随机片段的ssDNA文库中筛选出以高亲和力特异结合BACE1的适配子。利用基于生物素-链亲和素系统的间接ELISA法和pull-down实验来测定适配子对BACE1的结合亲和力及特异性。利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)实验以检测适配子对BACE1体外活性的抑制作用。将适配子作用于M17-APPsw细胞(一种AD细胞模型),进行双抗夹心ELISA和western blot实验,检测适配子对AD细胞模型中BACE1活性的抑制效应。首先,体外构建合成两端为固定序列、中间为30 nt的随机序列、全长为73nt的ssDNA文库(Gp30)。以纯化的人BACE1蛋白胞外段为靶标,在微孔板上进行筛选。每一轮筛选过程主要包括ssDNA文库与BACE1孵育结合、洗涤分离未结合的寡核苷酸序列、不对称PCR扩增结合的寡核苷酸序列、切胶回收目的ssDNA得到次级文库、再将次文库与BACE1结合进行下一轮筛选等重复步骤。从第四轮筛选开始,亚文库先与空白孔孵育进行反筛,以去除非特异结合的序列。共进行了七轮SELEX筛选。将第七轮得到的ssDNA进行克隆、测序。用Primer 5.0软件分析测序结果,选择两端的固定序列与原库相同、中间含有30 nt随机片段的序列为目的序列,通过MEME在线软件对所得序列进行同源性分析,用RNA STRUCTURE 5.5软件测算二级结构。共挑选出四个重复序列,命名为适配子A1、A2、A3、A4。其中序列A1的出现频率最高。序列同源性分析未发现四个序列均共有的模序。二级结构分析显示四个序列均以茎环结构为主。为验证适配子的靶蛋白及对靶蛋白的亲和力,利用经典的ELISA法及生物素-链亲和素系统进行间接ELISA。将生物素标记的适配子呈两倍浓度梯度稀释,与BACE1孵育后再与辣根过氧化物酶标记的链亲和素孵育,TMB显色,测定450nm的吸光度值。将所测得的吸光度值与适配子的浓度通过Sigmaplot 12.0软件进行非线性回归分析得出解离常数(肠)值。用anti-BACE1抗体与BACE1孵育作为对照比较结合亲和力；用无关适配子(U31)与BACE1孵育作为对照比较结合特异性。结果显示适配子A1及A4的结合曲线拟合效果好,类似于BACE1抗体的拟合曲线(R值均达到0.99,P0.01)。而U31的结合曲线则不能拟合(P0.05)。适配子A1、A4对BACE1的结合亲和力分别为68.5655±8.1237 nM、15.3497±2.0262 nM,与BACE1抗体对BACE1的亲和力(2.7498±0.2785 nM)几乎相近。说明A1及A4能以高亲和力特异结合BACE1。利用链亲和素磁珠-pull down实验验证适配子是否能结合AD细胞模型(M17-APPsw细胞)中的BACE1。选择重复频率最高的生物素标记的A1与链亲和素磁珠孵育,再与M17-APPsw细胞蛋白提取液孵育。与适配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-适配子复合物上,经洗涤后复合物通过SDS-PAGE胶分离,在PVDF膜上用BACE1抗体显影。生物素标记的原文库Gp30、U31及不加适配子组作为对照。结果显示,A1组有明显的70 KDa的BACE1蛋白条带；Gp30组中70KDa处的条带极细；U31及不加适配子组均未在70 KDa处显现条带。说明A1能特异结合M17-APPsw细胞中的BACE1蛋白。下一步进行荧光共振能量转移实验检测A1是否能抑制BACE1的体外活性。BACE1底物两端分别连接一个荧光供体和猝灭受体,随着供体能量转移至受体,供体发出的荧光可被受体所猝灭。BACE1裂解底物时,由于不能发生能量转移,来自于供体的荧光不能被猝灭,荧光信号增加。当加入抑制剂时由于底物裂解被抑制,荧光信号减低。利用这一原理,将不同浓度的适配子A1加入BACE1及其荧光底物的混合物中,检测荧光强度的变化。BACE1的一种特异抑制剂、Gp30及U31作为对照。随着浓度增加,标准抑制剂组中荧光值逐渐下降,至500nM时荧光值较阳性对照显著减低(P0.01)。A1组在250 nM的终浓度时荧光值急速下降(P0.01)。Gp30及U31组荧光值无显著减低。按抑制率(%)=100-(IFi/IF0×100)算出对BACE1活性的抑制率(IFi为加入测试物后的荧光值,IFo为不加测试物即阳性对照的荧光值)。将抑制率与测试物浓度的对数值进行线性回归分析,拟合曲线,估算出A1的半数抑制浓度(IC50)为139.81 nM,小于标准抑制剂的IC50(242.50 nM)。说明A1对BACE1体外活性的抑制作用强。接着将不同浓度(200nM-10μM)的A1加入M17-APPsw细胞中培养24 h后进行MTT实验以检测A1对细胞存活率的影响。结果显示A1终浓度在不超过3μM的范围内M17-APPsw细胞存活率不受影响。不同浓度(0.1 μM-3μM)A1处理M17-APPsw细胞24 h后收集细胞蛋白提取液,进行双抗夹心ELISA法检测Aβ40及Aβ42含量。在A1终浓度为3 μM时,细胞内Aβ40及Aβ42浓度较空白组(未予任何处理组)均有显著下降(P0.01)。因此用3 μM的A1作用于细胞后,收集细胞蛋白提取液及培养基进行双抗夹心ELISA检测。3 μM的Gp30、U31处理组和空白组作为对照。结果显示M17-APPsw的细胞内分泌的Aβ40及培养基中分泌的Aβ40浓度均较对照组显著下降(P0.01)。同样,M17-APPwt的细胞内Aβ40及培养基中Aβ40浓度均较对照组显著下降(P0.01)。与Aβ40类似,M17-APPsw的细胞Aβ42及细胞培养基中Aβ42浓度均较对照组显著下降(P0.01)。为检测A1对AD细胞模型中sAPPβ蛋白表达的影响,对A1、Gp30及U31处理后的M17-APPsw细胞裂解物进行western blot实验。孵育的一抗分别为针对APP氨基端的APP抗体及anti-BACE1抗体。结果显示A1组的sAPPβ蛋白表达水平较各对照组显著下降(尸0.01、P0.05),各组间sAPPa及BACE1的表达量无明显差异。上述结果提示A1能抑制AD细胞模型中BACE1活性。本研究通过SELEX技术成功筛选得到能以高亲和力结合BACE1的DNA适配子,并证明该适配子具有抑制BACE1体外活性的作用。为新的强效特异的BACE1抑制剂的开发提供了研究基础,为AD治疗提供了新的方法和思路。
【关键词】：指数富集的配基系统进化 DNA适配子 淀粉样蛋白 β-淀粉样前体蛋白裂解酶1抑制剂
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-24
• 材料与方法24-39
• 1 实验材料24-28
• 2 实验方法28-38
• 3 统计学分析38-39
• 实验结果39-54
• 1 SELEX筛选目的ssDNA39-41
• 2 克隆测序后得到的重复序列41-43
• 3 间接ELISA法测定适配子对BACE1的亲和力43-44
• 4 Pull-down实验确定适配子结合的靶蛋白44-45
• 5 FRET法测定适配子抑制BACE1活性45-48
• 6 MTT实验检测适配子对细胞存活率的影响48
• 7 双抗夹心ELISA法测定适配子对细胞内A β产量的影响48-52
• 8 Western blot实验检测适配子对细胞内sAPPα、sAPP β水平的影响52-54
• 讨论54-57
• 小结57-58
• 参考文献58-68
• 综述68-75
• 参考文献72-75
• 论文发表情况75-76
• 致谢76-78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 高海飞;牛彦;许凤荣;梁磊;周博;李勇剑;王超;刘鹏;徐萍;;苯甲脒类BACE1抑制剂的设计和合成(英文)[J];Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences;2012年02期

2 ;[J];;年期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 梁惠玉;BACE1特异DNA适配子的筛选及其抑制BACE1作用的初步研究[D];南方医科大学;2014年

2 刘悦;糖尿病认知功能障碍患者血液硫化氢、BACE1和Aβ42变化的初步研究[D];重庆医科大学;2013年

，

本文编号：558952