Gx-50通过小胶质细胞受体α7 nAChR及TLR4介导的抗炎作用

发布时间：2017-08-10 06:00

  本文关键词：Gx-50通过小胶质细胞受体α7 nAChR及TLR4介导的抗炎作用

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【摘要】：阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经系统退行性疾病,表现为认知损伤和渐进性记忆障碍。其主要的病理特征是胞外β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)沉积形成老年斑和胞内tau蛋白超磷酸化形成神经纤维缠结。该病的病理机制十分复杂,与多种信号通路和因素相关,如Aβ、tau蛋白、神经元损伤、慢性炎症等。在众多机制中,脑内小胶质细胞介导的慢性神经炎症被认为与阿尔兹海默症的发生和发展有重要联系,从而受到广泛的关注和研究。研究目的:实验室前期研究表明,一种花椒中提取的天然化合物N-[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl]-3-phenyl-acrylamide(gx-50)对AD有显著的治疗作用,主要包括神经元保护、认知能力改善、抗Aβ聚集等功能;其次,基因芯片等结果表明,在原代的神经元中,与AD发生过程相关的一些基因、分子和信号通路也会在一定程度上受到gx-50的影响;此外,在小胶质细胞中,gx-50也表现出抑制Aβ诱导的趋化反应的作用。但目前并没有针对其在神经炎症反应方面的功能进行详细的研究。考虑到神经炎症在AD的发生和发展中具有的重要的作用,我们设计了一系列生物学实验来探究gx-50对Aβ诱导的炎症反应的是否具有以及如何产生抑制作用。研究方法:本实验的主要检测对象是Aβ诱导的小胶质细胞(BV2小胶质瘤细胞系和原代培养的小胶质细胞)及gx-50腹腔注射后APP转基因小鼠脑组织,通过检测其中的细胞因子、通路蛋白、受体等来确定gx-50对Aβ诱导的炎症反应的作用及其机制。通过炎症反应中的重要的促炎介质的检测确定gx-50的抗炎作用。分别用ELISA和Griess法检测细胞分泌的TNF-α、IL-1β、PGE2及NO等促炎介质的含量,并且用real-time PCR和Western blot方法检测组织或细胞内的IL-1β、COX2及i NOS表达。然后用免疫荧光的方法检测转基因小鼠脑切片中小胶质细胞活化情况。针对gx-50与α7 nAChR及其下游介导的抗炎通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT的关系进行研究。通过gx-50与α-Btx竞争性结合实验验证gx-50与α7 nAChR的结合作用,然后分别用real-time PCR和Western blot针对该受体m RNA及蛋白的表达情况进行研究,以确定gx-50对该受体表达是否有影响。此外,通过免疫荧光和Western blot的方法检测JAK2、STAT3、PI3K及AKT蛋白磷酸化水平从而确定α7 nAChR介导的JAK2/STAT3和PI3K/AKT信号通路的活化情况,并且通过分别加入α7nAChR、JAK2及PI3K特异性抑制剂α-Btx,AG490和LY294002来进一步验证gx-50与这两个通路的关系。然后,将细胞分别用α-Btx,AG490和LY294002等抑制剂预处理,再用Western blot和ELISA检测IL-1β的表达变化情况,以确定gx-50的抗炎作用是否与α7nAChR及其介导的抗炎通路相关。针对gx-50对TLR4及其下游介导的炎症通路NF-κB及MAPK的关系进行研究。通过real-time PCR和Western blot检测体内体外TLR4的m RNA和蛋白表达及TLR4招募蛋白My D88和TRAF6的蛋白表达情况。此外,通过免疫荧光和Western blot的方法检测NF-κB p65及IκB、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平从而确定TLR4介导的NF-κB及MAPK信号通路的活化情况。然后,分别用si RNA及过表达质粒干扰和过表达TLR4,通过对TLR4介导的信号通路的抑制和活化情况进一步确定gx-50对该受体介导的炎症通路的影响。研究结果:Gx-50在体内体外对Aβ诱导的神经炎症均有显著的抑制作用。对小胶质细胞促炎介质的检测结果表明Aβ能刺激小胶质细胞中促炎介质的释放,包括TNFα(998.43±26.29 pg/ml),IL-1β(437.97±72.84 ng/ml),PGE2(58.72±3.41 ng/ml)及NO(3.13±0.34μM),而gx-50预处理后这些促炎介质的表达量显著地下降,分别为695.29±74.56 pg/ml,293.17±10.26 ng/ml,37.05±2.15 ng/ml和1.55±0.05μM。此外,Western blot结果进一步证实了gx-50能显著抑制COX2和i NOS的表达。对APP-Tg小鼠脑中促炎介质的检测结论与小胶质细胞结论一致,gx-50能显著地抑制Aβ刺激的促炎介质IL-1β,COX2和i NOS的m RNA及蛋白表达。免疫荧光结果显示gx-50可以抑制小胶质细胞的活化。Gx-50的抗炎机制可能与α7nAChR及下游通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT相关。gx-50可以与α7 nAChR相结合,且不论是在正常或病理情况下,gx-50均能上调该受体表达。对α7 nAChR介导的信号通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT的检测结果显示,gx-50能上调JAK2、STAT3、PI3K和AKT的蛋白磷酸化,而AG490、LY294002及α-Btx预处理分别抑制了gx-50这一作用,说明了gx-50通过α7nAChR的激活调控JAK2/STAT3和PI3K/AKT信号通路。此外,抑制剂α-Btx、AG49和LY294002的预处理抑制了gx-50对Aβ诱导的IL-1β的下调作用。在病理条件下,gx-50能直接抑制TLR4介导的炎症通路。gx-50可以抑制TLR4的活化,在Aβ或APP+/saline组中TLR4,My D88和TRAF6的表达显著地增加了,gx-50预处理后其表达量均受到了显著地抑制。对体内体外TLR4介导的炎症通路NF-κB及MAPK的检测结果显示,gx-50能显著抑制这两个炎症通路蛋白磷酸化水平。gx-50能抑制Aβ42诱导的IκB的磷酸化表达及NF-κB p65蛋白入核,从而抑制其对下游促炎基因的调控;免疫荧光结果进一步证实了这一点:Aβ刺激NF-κB p65入核,而与其相比,gx-50预处理后NF-κB p65更集中于胞浆中。此外,gx-50能显著地抑制Aβ42诱导的p-ERK1/2,p-p38的表达水平。上述结果表明gx-50显著地抑制了Aβ诱导的TLR4介导的炎症通路的活化。然而,当si RNA干扰TLR4表达时,以IL-1β和TRAF6为例,它们的表达量受到了显著的抑制,与未干扰组相比下降了50%,该效果与gx-50相一致,当TLR4过表达后,gx-50仍对My D88和TRAF6的表达起到抑制作用,使其表达量分别下降了38%和15%。综上所述,gx-50表现出强烈的抗炎作用,该作用体现在多个方面。首先,gx-50能激活炎症负反馈通路。gx-50能与α7nAChR相结合,使其激活进而导致下游通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT的激活,而这两个通路对炎症通路起到负调控作用,进而起到抗炎作用。另一方面,gx-50能抑制炎症通路。gx-50能抑制Aβ诱导的TLR4激活,进而导致其下游招募蛋白My D88和TRAF6的减少,从而导致炎症通路NF-κB及MAPK的抑制,最终起到了抗炎作用。
【关键词】：阿尔兹海默症 炎症反应 小胶质细胞 gx-50 "7 nAChR/TLR4
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-21
• 第一章 绪论21-39
• 1.1 阿尔兹海默症21-23
• 1.2 β 淀粉样蛋白与AD23-27
• 1.2.1 β 淀粉样蛋白生成23
• 1.2.2 淀粉样蛋白假说及Aβ 在AD中的作用23-27
• 1.3 小胶质细胞与AD27-28
• 1.3.1 小胶质细胞功能简介27
• 1.3.2 小胶质细胞在AD中的作用27-28
• 1.4 炎症与AD的关系28-31
• 1.4.1 炎症在神经系统中的作用28-29
• 1.4.2 慢性神经炎症与AD的关系29-31
• 1.5 α7 烟碱型乙酰胆碱受体与AD31-33
• 1.5.1 α7 烟碱型乙酰胆碱受体的功能31-32
• 1.5.2 α7 nAChR抗炎作用32-33
• 1.6 关于AD的药物研究33-39
• 1.6.1 AD临床治疗药物现状及AD药物研究几大方向33-34
• 1.6.2 抗炎药物研究34-36
• 1.6.3 gx-50 的相关研究36-39
• 第二章 gx-50 对 α7 nAChR及其下游通路的作用39-74
• 2.1 背景介绍39-40
• 2.2 实验材料及仪器40-42
• 2.3 试剂配制42-44
• 2.4 实验方法44-52
• 2.4.1 BV2小胶质系细胞培养及加药处理44-45
• 2.4.2 CCK8细胞活性检测45
• 2.4.3 受体结合实验45
• 2.4.4 从细胞中提取RNA及反转录45-46
• 2.4.5 荧光实时定量PCR（Quantitative Real time PCR ）检测46-47
• 2.4.6 从细胞中提取蛋白47-48
• 2.4.7 免疫蛋白印迹（Western Blot）检测48-50
• 2.4.8 细胞免疫荧光分析50
• 2.4.9 细胞因子检测50-51
• 2.4.10 统计学方法51-52
• 2.5 实验结果52-69
• 2.5.1 gx-50 可与 α7 nAChR结合并影响其表达52-56
• 2.5.2 gx-50 对JAK2活化的影响56
• 2.5.3 gx-50 对STAT3活化的影响56-60
• 2.5.4 gx-50 对PI3K活化的影响60-63
• 2.5.5 gx-50 对AKT活化的影响63
• 2.5.6 gx-50 对小胶质细胞炎症介质表达的影响63-67
• 2.5.7 α7 nAChR抑制后gx-50 对炎性因子IL-1β 的影响67-69
• 2.6 结果讨论69-74
• 第三章 gx-50 对Aβ 诱导的神经炎症的影响74-110
• 3.1 背景介绍74-75
• 3.2 实验材料及仪器75-76
• 3.3 试剂配制76-77
• 3.4 实验方法77-86
• 3.4.1 大鼠原代小胶质细胞分离和培养77
• 3.4.2 流式细胞术（flow cytometry，FCM）鉴定小胶质细胞77-78
• 3.4.3 痴呆小鼠模型78
• 3.4.4 从细胞/组织中RNA提取及反转录78-79
• 3.4.5 荧光实时定量PCR（Quantitative Real time PCR ）检测79-80
• 3.4.6 从细胞/组织中提取蛋白80
• 3.4.7 小胶质细胞浆蛋白及核蛋白提取80-81
• 3.4.8 Western Blot81-82
• 3.4.9 转基因小鼠脑组织切片免疫荧光双染色分析82-83
• 3.4.10 siRNA干扰TLR4表达实验83
• 3.4.11 小鼠tlr4原核表达质粒构建和转染83-86
• 3.4.12 统计学方法86
• 3.5 实验结果86-104
• 3.5.1 原代培养小胶质细胞的鉴定86
• 3.5.2 gx-50 对转基因小鼠炎症介质表达的影响86-90
• 3.5.3 gx-50 对转基因小鼠脑内小胶质细胞活化的影响90-92
• 3.5.4 gx-50 对核转录因子NF-κB及IκB的影响92-95
• 3.5.5 gx-50 对MAPKs通路磷酸化的影响95-97
• 3.5.6 gx-50 对TLR4及其下游招募蛋白的影响97-99
• 3.5.7 TLR4敲除后gx-50 对该通路的影响99-101
• 3.5.8 TLR4过表达后gx-50 对该通路的影响101-104
• 3.6 结果讨论104-110
• 第四章 全文总结110-112
• 参考文献112-124
• 致谢124-126
• 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文126-128

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