迷迭香酸对CUS大鼠抑郁样行为的改善作用及其机制研究

发布时间：2017-08-14 08:03

  本文关键词：迷迭香酸对CUS大鼠抑郁样行为的改善作用及其机制研究

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【摘要】：研究目的:本研究的主要目的是应用慢性不可预见应激(chronic unpredictable stress,CUS)的大鼠模型进行研究,探讨迷迭香酸(Rosmarinic acid,RA)对CUS大鼠抑郁样行为的改善作用以及对大鼠海马区域细胞外信号调节激酶(extracellular-regulated kinase,ERK)信号传递的改变,海马的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)水平的调节是否是RA改善CUS模型大鼠抑郁样行为的基础。此外,本研究还通过离体研究观察了RA对海马星形胶质细胞活力、增殖的作用以及对其ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表达的影响,以进一步探讨RA发挥抗抑郁作用的细胞学基础。研究方法:1、观察RA干预对CUS抑郁模型大鼠的抑郁样行为及海马ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表达的影响。雄性Sprague Dawley(SD)大鼠被随机分为6组,每组16只:(1)对照组(sham+vehicle),实验大鼠常规饲养2周后,每天腹腔注射生理盐水,连续2周;(2)对照+RA低剂量组(sham+RA(L)),实验大鼠常规饲养2周后,每天腹腔注射RA(5mg/Kg体重),连续2周;(3)对照+RA高剂量组(sham+RA(H)),实验大鼠常规饲养2周后,每天腹腔注射RA(10 mg/Kg体重),连续2周;(4)模型组(CUS+vehicle),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射生理盐水,连续2周;(5)模型+ra低剂量组(cus+ra(l)),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射ra(5mg/kg体重),连续2周;(6)模型+ra高剂量组(cus+ra(h)),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射ra(10mg/kg体重),连续2周。ra干预结束后,对实验设计中的部分大鼠(每组8只,共计48只)进行强迫游泳实验和旷场实验、测试后,提取大鼠的海马组织蛋白样品,分别检测bdnf、gdnf、erk1/2、perk1/2的水平。其余8只大鼠进行水迷宫实验。2、应用erk磷酸化抑制剂u0126干预后,观察ra干预对cus抑郁模型大鼠的抑郁样行为及海马erk1/2磷酸化水平和bdnf表达的作用。结合第一部分实验的结果,实验二仍然分为6组,每组16只:(1)对照组(sham+vehicle),实验大鼠常规饲养2周后,每天腹腔注射生理盐水,连续2周,并且在注射生理盐水前30min注射对照溶剂(0.6ml/kg体重);(2)对照+u0126组(sham+u0126),实验大鼠常规饲养2周后,每天腹腔注射生理盐水,连续2周,并且在注射生理盐水前30min注射u0126(0.5mg/kg体重);(3)模型组(cus+vehicle),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射生理盐水,连续2周,并且在注射生理盐水前30min注射对照溶剂(0.6ml/kg体重);(4)模型组+u0126组(cus+u0126),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射生理盐水,连续2周,并且在注射生理盐水前30min注射u0126(0.5mg/kg体重);(5)模型+ra高剂量组(cus+ra(h)),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射ra(10mg/kg体重),连续2周,并且在注射生理盐水前30min注射对照溶剂(0.6ml/kg体重);(6)模型+ra高剂量+u0126组(cus+ra(h)+u0126),大鼠接受为期3周的慢性不可预见应激,从第3周干预开始,每天腹腔注射ra(10mg/kg体重),连续2周,并且在注射生理盐水前30min注射u0126(0.5mg/kg体重)。对照溶剂为二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)水溶液(dmso:生理盐水=1:4)。与第一部分实验指标相同,干预结束后对部分大鼠(每组8只)进行强迫游泳和旷场实验测试后,取其海马组织蛋白样品,分别检测bdnf、erk1/2、perk1/2的水平。其余大鼠进行水迷宫实验。3、原代培养海马星形胶质细胞,观察不同剂量ra对该细胞活力、erk1/2磷酸化水平和bdnf表达的影响。并在此基础上添加u0126,观察不同剂量ra对星形胶质细胞erk1/2磷酸化水平和bdnf表达的影响。通过原代培养的方法获得新生sd大鼠海马星形胶质细胞,经纯度鉴定后,接种于96或6孔细胞培养板中,待贴壁牢固后,加入不同浓度的ra(ra经dmem稀释后,配置成10、50、100、200和400μg/ml的10×母液,在原培养体系中加入培养液1/10的母液即可达到终浓度,对照组加入相应体积的dmem),作用48h后,通过wst-1方法检测细胞活力,通过brdu掺入实验观察ra对星形胶质细胞增殖的作用,同时取细胞上清液检测bdnf释放的情况,并且提取蛋白,用westernblot方法检测erk1/2,perk1/2的表达情况。另一部分星形胶质细胞在培养体系中加入u0126(终浓度2μm),接种方式和检测指标同前。4、原代培养海马星形胶质细胞,观察不同剂量ra对该细胞活力、增殖情况和gdnf表达的影响。海马星形胶质细胞经纯度鉴定后,接种于96或24孔细胞培养板中,待贴壁牢固后,加入不同浓度的ra(ra经dmem稀释后,配置成10、50、100、200和400μg/ml的10×母液,在原培养体系中加入培养液1/10的母液即可达到终浓度,对照组加入相应体积的dmem),作用48h或72h后,取细胞上清液检测gdnf释放的情况。并且在作用72h后,通过wst-1方法检测细胞活力,通过brdu掺入实验观察ra对星形胶质细胞增殖的作用。结果:实验一部分显示,大鼠经cus处理后表现出明显的抑郁样行为并且海马磷酸化erk1/2的表达和bdnf、gdnf的水平均下调;而经ra干预后,抑郁模型大鼠的抑郁样行为得到改善并且海马磷酸化erk1/2的表达和bdnf、gdnf的水平上调。具体如下:1.与对照处理相比,cus处理后大鼠:(1)在旷场实验中,水平运动距离减少(p0.01);(2)强迫实验中的大鼠不动时间延长(p0.01);(3)morris水迷宫实验中,在目标象限停留时间缩短(p0.01);(4)westernblot检测结果显示,海马erk1/2的表达没有显著影响,但是抑制了perk1/2的表达(p0.01);(5)elisa结果显示,海马bdnf、gdnf水平下降(均为p0.01)。2.与cus组相比,经高剂量ra(10mg/kg体重)治疗后的大鼠:(1)在旷场实验中,水平运动距离增加(p0.05);(2)强迫游泳不动时间缩短(p0.05);(3)水迷宫实验中,在目标象限停留时间延长(p0.05);(4)westernblot检测结果显示,海马erk1/2的表达没有显著影响,但是perk1/2的表达上调(p0.05);(5)elisa结果显示,海马bdnf、gdnf水平上调(均p0.05)。实验二部分,研究发现ra对抑郁动物行为的改善作用可以被u0126所阻断,而且westernblot的结果也显示u0126不仅抑制了ra对抑郁动物海马erk1/2磷酸化的上调作用,而且抑制了其对bdnf的调节作用。具体如下:1.双因素方差分析结果显示,造模与否(shamvs.cus)在旷场实验的水平运动距离(f=27.088,p=0.000),强迫游泳不动时间(f=15.924,p=0.000)以及水迷宫实验中,在目标象限停留时间(f=28.233,p=0.000)均存在显著性差异。此外,各干预因素(包括对照溶剂、u0126、ra以及ra+u0126)之间对动物行为学的作用也存在显著性差异,包括旷场实验的水平运动距离(f=3.247,p=0.031),强迫游泳不动时间(f=3.981,p=0.014)以及水迷宫实验中,在目标象限停留时间(f=3.800,p=0.017);而且处理方式和干预这两种处理对上述三项行为学指标的影响不存在交互作用。进一步多重比较发现,ra高剂量组与ra高剂量+u0126在上述三项行为学检测指标中均存在显著性差异(p0.05)。2.实验二也观察了不同处理方式和干预因素对海马perk1/2和bdnf的水平的影响。其中,造模与否之间perk1/2的表达(f=30.712,p0.001)和bndf的水平(f=18.920,p=0.001)存在显著差异;不同干预方式之间perk1/2的表达(f=4.772,p=0.008)和bndf的水平(f=2.646,p=0.041)也存在显著差异。造模与否与不同干预方式之间不存在交互作用。多重比较结果显示,ra高剂量组与ra高剂量+u0126在perk1/2的表达和bndf的水平中均存在显著性差异(p0.05)。实验三部分,通过原代培养获得星形胶质细胞,在细胞培养基中加入不同剂量的ra作用48h,结果显示:直接给予不同剂量ra对星形胶质细胞细胞活力(f5,30=0.456,p=0.806)和增殖水平(f5,20=0.766,p=0.912)并没有显著作用;对erk1/2的表达也没有显著影响(f5,24=0.098,p=0.992),但是对perk1/2(f5,24=3.147,p=0.025)以及bdnf(f5,30=2.615,p=0.045)的表达却存在显著差异。多重比较结果显示,在剂量为20μg/ml或40μg/ml时却可以促进erk磷酸化水平,而且在剂量为20μg/mL的情况下还可以促进BDNF的释放。经过U0126干预后,经双因素方差分析,星形胶质细胞ERK1/2的表达没有显著变化(F=0.245,P=0.992),但是对pERK1/2(F=0.591,P0.001)以及BDNF(F=22.277,P0.001)的表达却存在显著影响。而且不同RA剂量+U0126组之间均没有显著性差异(P0.05)。实验四部分,通过原代培养获得星形胶质细胞,在细胞培养基中加入不同剂量的RA作用48 h或72 h,结果显示:直接给予不同剂量RA作用72 h对星形胶质细胞细胞活力(F5,30=0.351,P=0.0306)和增殖水平(F5,25=6.693,P0.01)均具有促进作用;对BDNF(F5,30=3.251,P=0.016)的水平也具有促进作用。多重比较结果显示,在剂量为20μg/mL或40μg/mL时可以促进星形胶质细胞增殖,而且在剂量为20μg/mL的情况下还可以促进其细胞活力和GDNF的释放。结论:CUS模型大鼠表现明显的抑郁样行为,而一定剂量的RA干预能改善这一行为表现,并且缓解由CUS所致海马pERK1/2和BDNF、GDNF水平下降的情况,但是,应用ERK磷酸化抑制剂U0126可以阻断上述效应;一定剂量的RA还可以促进海马星形胶质细胞ERK磷酸化和BDNF的表达,这一作用同样可以被U0126阻断;此外,一定剂量的RA在作用72 h后可以促进星形胶质细胞增殖、上调细胞活力以及GDNF的释放。以上结果表明,RA可能是通过上调抑郁大鼠海马星形胶质细胞的ERK1/2磷酸化,促进其释放BDNF、GDNF,进而发挥抗抑郁效应的。
【关键词】：迷迭香酸 脑源性神经营养因子 胶质源性细胞因子 细胞外信号调节激酶1/2 海马 抑郁症
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.4
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-12
• ABSTRACT12-18
• 前言18-20
• 文献回顾20-49
• 1 抑郁症概况20-22
• 2 抑郁症的发病机制研究22-30
• 3 抑郁症的治疗30-40
• 4 星形胶质细胞在抑郁症的发病和治疗中的作用40-49
• 实验一：迷迭香酸对CUS大鼠抑郁样行为的作用及海马ERK磷酸化和BDNF、GDNF表达的影响49-67
• 1 材料49-51
• 2 方法51-56
• 3 结果56-62
• 4 讨论62-67
• 实验二：ERK信号通路在迷迭香酸发挥抗抑郁效应中的作用67-76
• 1 材料67
• 2 方法67-69
• 3 结果69-74
• 4 讨论74-76
• 实验三：迷迭香酸对海马星形胶质细胞BDNF表达的影响及其机制76-83
• 1 材料76-77
• 2 方法77-79
• 3 结果79-81
• 4 讨论81-83
• 实验四：迷迭香酸对海马星形胶质细胞增殖的作用及其GDNF表达的影响83-88
• 1 材料83
• 2 方法83-84
• 3 结果84-85
• 4 讨论85-88
• 小结88-90
• 参考文献90-112
• 个人简历和研究成果112-114
• 致谢114

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本文编号：671578