骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠行为学及钙通道影响的研究

发布时间：2017-08-14 10:08

  本文关键词：骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠行为学及钙通道影响的研究

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【摘要】：【目的】通过复制血管性痴呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并对其进行行为学和钙通道相关信号通路检测，探讨VaD大鼠钙通道信号通路的改变，分析其改变引起记忆认知障碍的可能机制。同时进一步探讨骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）移植对VaD大鼠认知功能的改善和钙通道以及与钙通道相关信号通路的影响机制，为BMSCs的临床应用提供适用性资料。 【方法】（1）通过贴壁筛选的方法分离、培养BMSCs，至第五代细胞纯化后，用流式细胞仪对所培养BMSCs进行流式表面抗原鉴定，成纤维生长因子（basicfibroblast growth factorbfic，bFGF）和丁羟基茴香醚（Beta HydroxyAcid，BHA）诱导BMSCs分化为神经元细胞，并对诱导后的细胞，进行神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron speeific enolase，NSE)表达的免疫组化鉴定。诱导后的BMSCs于移植前24h在其培养液中加入浓度为10μmol/L的标记物5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)，离心收集标记后的BMSCs，备用。（2）提前进行大鼠水迷宫智力筛查，大鼠随机分为对照组和模型组，模型组用改良Pulsinelli’s四血管阻断法复制VaD模型，对照组只分离椎动脉和颈总动脉，不进行椎动脉凝闭和颈总动脉的夹闭。30天后筛选模型组中认知功能障碍的大鼠再分为模型对照组和干细胞治疗组。干细胞治疗组将诱导后被BrdU标记的BMSCs细胞悬液通过脑立体定位仪注射到大鼠侧脑室，对照组和模型对照组注射等量培养基。细胞移植30天后进行水迷宫行为学测试，各组大鼠断头取脑，制备石蜡切片，苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色观察大鼠大脑海马区病理变化。（3）免疫组化染色方法检测移植的细胞在大鼠脑组织的表达情况；检测血浆和海马组织一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）活性和NO含量；提取血细胞和海马组织总RNA，Real-time PCR方法测定钙调蛋白（Calmodulin，CaM）、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII,CaMKII）和NOS mRNA表达含量；提取海马组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，用蛋白免疫印迹(Western Blotting)法检测钙调蛋白依赖性激酶（CaMKⅡ）和与钙通道相关的NOS蛋白酶的表达情况。比较对照组、模型对照组组和干细胞治疗组中各项指标，并对各组的含量做出差异性统计学分析。 【结果】（1）通过贴壁筛选法分离培养BMSCs，体外传代扩增后，流式细胞仪检测第五代BMSCs表达粘附分子CD90阳性率99.4%，CD29阳性率96.8%，CD44阳性率99.6%，CD45阳性率3.7%。诱导后的BMSCs可表达NSE和Nestin。（2）模型对照组组和干细胞治疗组与对照组相比，模型对照组组和干细胞治疗组大鼠平均逃避潜伏期明显长于对照组，撤去平台后，模型对照组和干细胞治疗组第1次穿越平台所用时间延长，穿越站台次数明显减少，存在统计学意义（P＜0.05）。干细胞治疗组较模型对照组逃避潜伏期缩短（P＜0.05），第1次穿越平台时间缩短，穿越平台次数增加，差异有统计学意义。（3）干细胞治疗组在移植后30天大鼠脑组织双侧半球切片中可见BrdU染色阳性细胞分布，BrdU阳性反应物呈棕褐色、颗粒状或弥漫性分布，位于细胞核内。（4）通过对比分析对照组、模型对照组和干细胞治疗组与钙通道及钙信号相关指标的表达差异，结果显示模型对照组上述酶的活性、mRNA和蛋白表达水平较对照组高（P＜0.05），，而干细胞治疗组与模型对照组相比，CaMKⅡ、CaM、NOS和NO表达降低（P＜0.05）。 【结论】（1）BMSCs在体外经bFGF/BHA诱导可分化为神经元样细胞，且可表达Nestin和NSE。（2）VaD模型大鼠与钙通道主要相关的NOS和CaMKII信号表达增高，提示钙超载参与到了VaD所引起的认知障碍机制中。(3)诱导后的BMSCs可以被BrdU标记，以立体定向途径移植的BMSCs可在宿主脑内存活。(4)诱导后的BMSCs可通过改善神经受损引起的钙超载来改善模型大鼠的认知功能。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 血管性痴呆 NOS CaMKII 神经元 分化 诱导
【学位授予单位】：贵阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.13
【目录】：

• 摘要4-6
• 前言6-9
• 材料与方法9-24
• 结果24-36
• 讨论36-43
• 结论43
• 论文创新点43
• 研究生期间发表论文情况43
• 研究生期间参与科研项目43-44
• 参考文献44-49
• Abstract49-52
• 致谢52-53
• 缩略词表53-54
• 附：综述54-71
• 参考文献68-71

【参考文献】

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1 周晖;孙小妹;罗小丽;毛萌;;钙及钙调蛋白依赖性激酶在神经元缺氧损伤中的作用[J];中国当代儿科杂志;2007年04期

2 吴莹;温优良;杜丽;;生脉散对VD大鼠行为学及海马组织NOS和神经元细胞凋亡的影响[J];南方医科大学学报;2010年06期

3 陈冬;刘青;陈书起;;线粒体膜通透性转运孔与缺血缺氧性脑损伤[J];中国健康心理学杂志;2011年03期

4 覃汝天;;老年性痴呆的临床研究进展[J];求医问药(下半月);2011年07期

5 李晓明,李建国,胡平,杨建明,王颖,李晓文,高天明;大鼠全脑缺血后海马CA1区锥体神经元L型钙通道电流的改变(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2003年05期

6 侯玲玲,郑敏,王冬梅,袁红丰,李海民,陈琳,白慈贤,张涌,裴雪涛;人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化[J];生理学报;2003年02期

7 高明奇,孙黎光,张天彪,滕赞,刘素媛;铅对小鼠学习记忆及脑海马细胞内钙库释放的影响[J];卫生研究;2005年04期

8 张会珍;张丽欣;佘延芬;李文丽;张雪静;张瑞娟;;电针对拟血管性痴呆小鼠脑组织海马细胞凋亡的影响[J];针刺研究;2008年06期

9 冯进益;尤元璋;李偏;蔡志刚;芮钢;;BrdU标记大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨能力的变化[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年19期

10 杨诗梅;陆世丰;费小明;张建富;沈文怡;李建勇;陆化;;骨髓衰竭患者骨髓间充质干细胞细胞因子的表达变化及其意义[J];中国实验血液学杂志;2010年06期

本文编号：672098