荧光交叉关联光谱检测Aβ寡聚体与kinesin-1蛋白相互作用

发布时间：2017-08-17 11:01

  本文关键词：荧光交叉关联光谱检测Aβ寡聚体与kinesin-1蛋白相互作用

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【摘要】：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD),又称老年性痴呆,是中枢神经系统一种常见的神经退行性疾病,其主要病理特征为细胞外老年斑(senile plaques, SPs)和细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。虽然AD的确切病因和发病机制仍未清楚,但β淀粉样蛋白假说(amyloid-β,Aβ)是目前公认的主流学说。Aβ过产和/或Aβ清除障碍造成的细胞外SPs可能是其主要致病因素,其中,可溶性Aβ寡聚体相对于单体和纤维状Aβ则具有更强的毒性作用,特别是Aβ42寡聚体,可能是主要的致病因子。研究发现在AD患者和动物模型中存在着轴突运输功能紊乱现象,且有证据显示驱动蛋白kinesin在其中扮演着重要的角色,因此,研究Aβ寡聚体与kinesin间相互作用将有助于揭示AD的发病机制,为AD的诊断与防治提供更多的理论与实验依据。 双色荧光交叉关联光谱(dual color-fluorescence cross correlation spectroscopy, DC-FCCS)是一种通过测量溶液中微小尺度内荧光强度随时间的涨落而进行分析的单分子荧光检测技术,可检测两种荧光组分的信号,尤其适于生物大分子间相互作用的研究。虽然β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)与kinesin蛋白的直接相互作用已有体内和体外实验证明,但Aβ寡聚体与kinesin的直接相互作用研究还未见报道,尤其是在单分子水平上对二者相互作用的直接观察,因此,我们通过扩增了kinesin-1轻链蛋白(kinesin light chain, KLC)的编码序列,构建质粒、表达并纯化了KLC-EGFP-His(以下简写KLC-E)和EGFP-KLC-His(以下简写E-KLC)两种融合蛋白,建立了DC-FCCS观察Aβ寡聚体与KLC融合蛋白间相互作用的的检测方法,并探讨了反应计量关系和EGFP标签位置对二者作用的影响。 本课题选用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统进行目的蛋白的真核表达,首先扩增KLC和EGFP编码序列,然后分别将两个片段按不同顺序连接到pFastBacl载体上,并在各自C端连接His标签编码序列；获得重组质粒转化到E.coli DH10Bac感受态中,包装重组杆状病毒DNA分子并转染Sf9细胞；包装并扩增出强感染力重组杆状病毒,分别感染Sf9细胞过表达KLC-E和E-KLC融合蛋白,并进行蛋白纯化；Atto647N NHS ester荧光染料标记Aβ42单体并制备寡聚体；Aβ42寡聚体与目的蛋白孵育并进行DC-FCCS检测。实验结果显示,在0-4h内,Aβ42寡聚体与KLC-E和E-KLC间结合效率均逐渐增强；并且随着时间推移,高、低计量反应的KLC-E和E-KLC均会促进Aβ42寡聚体的进一步聚集,但在低计量反应下,E-KLC对Aβ42寡聚化促进程度稍大于KLC-E;高计量反应的KLC-E和E-KLC相较于低计量反应,与Aβ42寡聚体的结合效率更高,但无论高、低计量反应,E-KLC与Aβ42寡聚体的结合效率显著大于KLC-E与Aβ42寡聚体结合效率。
【关键词】：阿尔茨海默病 Aβ42寡聚体 驱动蛋白 双色荧光交叉关联光谱
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 1 引言12-19
• 1.1 研究背景和意义12-13
• 1.2 Ap寡聚体形成及其毒性作用13-14
• 1.3 kinesin蛋白及其在AD病理性研究中进展14-15
• 1.4 荧光关联光谱技术及其在AD研究中的应用15-17
• 1.5 实验设计与流程17-19
• 2 实验材料19-24
• 2.1 细胞、载体与宿主菌19
• 2.2 工具酶与试剂盒19
• 2.3 主要生化试剂19-20
• 2.4 主要实验仪器20
• 2.5 主要溶液配制20-24
• 3 实验方法24-38
• 3.1 细胞培养24-25
• 3.2 质粒构建与鉴定25-34
• 3.2.1 目的基因获得25-29
• 3.2.2 质粒构建29-31
• 3.2.3 转座31
• 3.2.4 重组杆状病毒基因组DNA(rBacmid DNA)的提取31
• 3.2.5 rBacmid DNA的PCR鉴定31-32
• 3.2.6 重组杆状病毒的获得32-33
• 3.2.7 Western blot鉴定目的蛋白表达33-34
• 3.3 目的蛋白纯化34-35
• 3.4 Aβ42单体标记及寡聚体制备35
• 3.5 DC-FCCS检测Aβ42寡聚体与KLC间相互作用35-38
• 3.5.1 仪器及参数35-37
• 3.5.2 激发体积的校正37-38
• 4 实验结果38-48
• 4.1 细胞培养38
• 4.2 质粒构建与鉴定38-42
• 4.2.1 目的基因和载体获得38-40
• 4.2.2 携带KLC-E、E-KLC的杆状病毒表达载体的构建40-41
• 4.2.3 表达KLC-E、E-KLC蛋白的重组杆状病毒的获得41-42
• 4.3 Western blot鉴定目的蛋白表达42-43
• 4.4 目的蛋白纯化43-45
• 4.5 DC-FCCS检测Aβ42寡聚体与KLC相互作用45-48
• 4.5.1 Aβ42寡聚体与KLC相互作用的动力学过程45-46
• 4.5.2 KLC计量效应对Aβ42寡聚体尺寸的影响46-47
• 4.5.3 EGFP标签对Aβ42寡聚体与KLC结合效率的影响47-48
• 5 讨论48-51
• 6 结论51-52
• 参考文献52-57
• 附录A57-59
• 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果59-61
• 学位论文数据集61

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本文编号：688622