抗Abeta抗体在阿尔茨海默病免疫治疗中的作用及机制研究
本文关键词：抗Abeta抗体在阿尔茨海默病免疫治疗中的作用及机制研究
更多相关文章： 阿尔茨海默病 Aβ 免疫治疗 副作用 Aβ自身抗体 外周清除
【摘要】：背景和目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人群最常见的神经退行性疾病,其发病机理尚不清楚。临床上对于AD主要为对症治疗,目前尚无有效治疗方法能够终止或延缓疾病的进展。淀粉样蛋白β(amyloid-beta,Aβ)是AD的核心治病物质,Aβ在脑内沉积形成老年斑(senile plaque)是AD的主要病理变化。针对Aβ的免疫治疗,包括主动免疫(Aβ疫苗)和被动免疫(Aβ抗体),在AD动物模型中被证实有效。而AD免疫治疗的临床试验目前均以失败告终,主要失败原因之一为副作用的发生,具体机制尚不清楚。人体内广泛存在天然Aβ自身抗体(NAbs-Aβ),研究表明NAbs-Aβ能够拮抗Aβ的神经毒性作用,对AD起保护作用。静脉用免疫球蛋白(Invtrovenous immunoglobulin,IVIg)因含有NAbs-Aβ而被用于AD的治疗研究,而其临床试验也因认知改善不明显而提前终止。Aβ的聚合的关键位点与其毒性片段均位于Aβ中段。Aβ的结构分析提示,Aβ氨基端(N端)纤维暴露在Aβ纤维的周围,而羧基端(C端)和中段均位于Aβ纤维的核心。前期研究结果表明,针对Aβ-N端的单克隆抗体能够促进Aβ的产生,从而促进AD的发生和发展。目前免疫治疗临床试验中所采用的抗体大多均为针对N端的抗体。在此研究中,我们旨在探索NAbs-Aβ表位相关的功能异质性。同时,免疫治疗的副作用可能与抗体促进Aβ斑块解聚为毒性更强的寡聚体有关,我们探索了针对不同表位的抗体对Aβ纤维的解聚作用以及对Aβ神经毒性的影响。另外,由于免疫治疗的副作用均与抗体进入脑内发挥作用有关,Aβ水平在脑内与外周存在动态平衡,我们提出通过脑外途径清除Aβ可能是更为安全的治疗策略,我们在慢性肾病患者中探索了肾脏对Aβ的清除作用。同时,鉴于新药物的副作用,我们从临床现用药物中筛选出用于急性缺血性卒中的药物依达拉奉,在动物模型中探索其对AD的防治效果。材料与方法第一部分:检测和比较AD患者(132例)和健康对照者(Healthy Control,HC,120例)中NAbs-Aβ的水平:采用ELISA和Western Blot方法,检测AD患者和HC血清和脑脊液nabs-aβ的总体水平;采用elisa方法,检测ad患者和hc血清和脑脊液nabs-aβ的表位;分析不同表位nabs-aβ水平与血液和脑脊液aβ水平、mmse评分以及cdr评分的相关性。分离不同表位的nabs-aβ:采用亲和层析的方法,从静脉用丙种球蛋白(intravenousimmunoglogulin,ivig)。为从ivig获得针对不同表位的nabs-aβ,将不同aβ表位肽,通过连接臂化学桥联至凝胶基质,制成不同aβ表位肽特异性的亲和层析柱。对不同表位nabs-aβ进行功能鉴定:在表达appsweps1wt的cho细胞株培养体系中,观察不同表位的nabs-aβ对aβ产生的影响;采用tht和电镜等方法,研究针对不同表位的nabs-aβ对aβ聚集的影响;在sh-sy5y细胞培养中,采用mtt试验和轴突生长试验,检测不同表位nabs-aβ对aβ神经毒性(神经元死亡和轴突生长抑制)的拮抗作用;将分离出的不同表位nabs-aβ,给予3月龄app-swepsen1de9转基因小鼠脑内注射,观察nabs-aβ对aβ代谢及神经元凋亡的影响。第二部分:aβ单体在37℃孵育成aβ纤维,通过tht、westernblot和tem试验方法,观察aβ-n端抗体6e10、aβ中段抗体4g8、aβ-c端抗体8g7对aβ纤维的解聚作用,pbs作为阴性对照。mtt试验和轴突生长试验观察针对不同表位的抗体解聚aβ纤维后对aβ神经毒性作用的影响。向3月龄c57雌性小鼠侧脑室注射抗体解聚aβ纤维后的产物,观察神经元凋亡情况。第三部分:肾脏对aβ清除作用的临床研究。采用elisa方法,检测慢性肾病(chronickidneydisease,ckd)患者(47例,其中透析31例,未透析16例)和hc(43例)外周血aβ40和aβ42水平。分析外周血aβ水平在透析ckd患者、未透析ckd患者和hc中的差异及其与肾功能的关系。结果1:在外周血和脑脊液中,ad患者nabs-aβ总体水平及针对不同表位nabs-aβ水平较正常人显著降低;外周血和脑脊液中,ad患者针对中段的nabs-aβ比例较hc显著降低;脑脊液中,ad患者针对n端的nabs-aβ比例较正常人显著升高;针对所有表位的nabs-aβ均能拮抗aβ的神经毒性作用,而针对中段的nabs-aβ对aβ毒性的拮抗作用最强;针对中段的nabs-aβ能够显著抑制aβ聚集;针对n端的nabs-aβ能够与神经元结合并促进aβ产生;针对n端的nabs-aβ能够促进神经元凋亡。2:6e10可促进aβ纤维解聚为寡聚体,而4g8、8g7无解聚作用;n端抗体6e10解聚纤维的解聚物具有抑制细胞轴突生长、促进神经元死亡的作用;6e10解聚物能够显著促进小鼠脑内神经元凋亡,而4G8、8G7则无此作用。3:未透析CKD患者外周血Aβ40和Aβ42水平较HC显著升高,而透析CKD患者外周血Aβ40和Aβ42水平较HC无显著差异;外周血Aβ40和Aβ42水平与肾小球滤过率呈负相关。结论1:NAbs-Aβ具有表位相关的功能异质性,即中段NAbs-Aβ能够显著抑制Aβ聚集、拮抗Aβ神经毒性作用,从而具有神经保护作用;而N端NAbs-Aβ则能够与神经元直接结合并促进Aβ产生,促进神经元凋亡;AD患者体内Aβ自身抗体谱呈现特征性紊乱,即中段的NAbs-Aβ比例相对降低而N端NAbs-Aβ比例相对升高,Aβ自身抗体谱的紊乱可能参与了AD的发生和发展,同时具有一定的临床诊断价值;2:N端Aβ抗体能够促进Aβ纤维解聚为寡聚体,特别是毒性较强的Aβ二聚体和三聚体的产生,从而进一步加重Aβ的神经毒性作用;此效应可能是免疫治疗副作用产生的重要机制之一;因此免疫治疗应该避免使用针对N端的抗体;3:肾脏对外周Aβ具有清除作用,提示外周器官可能参与了Aβ的代谢;同时,透析能够有效清除血液Aβ,为Aβ“外周清除”的可行性提供了依据。
【关键词】：阿尔茨海默病 Aβ 免疫治疗 副作用 Aβ自身抗体 外周清除
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：
- 缩略语表5-7
- 英文摘要7-10
- 中文摘要10-13
- 前言13-16
- 第一部分 ABETA自身抗体表位相关的功能异质性及在阿尔茨海默病中的意义16-59
- （一） ABETA自身抗体水平和表位检测16-31
- 1.1 材料16-20
- 1.2 主要实验方法20-24
- 1.3 主要实验结果24-31
- （二） 不同表位ABETA自身抗体功能研究31-59
- 2.1 材料31-35
- 2.2 主要实验方法35-43
- 2.3 主要实验结果43-54
- 2.4 讨论54-59
- 第二部分 抗ABETA抗体对ABETA纤维的解聚和神经毒性的影响59-75
- 1.1 材料59-62
- 1.2 主要实验方法62-67
- 1.3 主要实验结果67-73
- 1.4 讨论73-75
- 第三部分 肾脏对ABETA清除作用的研究75-82
- 1.1 材料75
- 1.2 主要实验方法75-77
- 1.3 主要实验结果77-79
- 1.4 讨论79-82
- 全文结论82-83
- 今后研究方向83-84
- 参考文献84-94
- 文献综述一 Immunotherapy for Alzheimer disease the challenge of adverse effects94-106
- 参考文献102-106
- 文献综述二 Immunity and Alzheimer’s disease: immunological perspectives in developmentof novel therapies106-131
- 参考文献118-131
- 攻读博士学位期间的研究成果131-133
- 致谢133
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7 Ben Hirschler 编译 储e，
本文编号：696404
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jsb/696404.html
