过表达MKP1通过抑制JNK途径减轻淀粉样蛋白的神经毒性作用

发布时间：2017-08-21 08:38

  本文关键词：过表达MKP1通过抑制JNK途径减轻淀粉样蛋白的神经毒性作用

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【摘要】：目的:β淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)可通过激活MAPK等信号途径诱发神经炎症和细胞凋亡,其神经毒性是阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病的关键原因。然而,Aβ激活MAPK途径的具体分子机制尚未完全阐明。本研究通过测定Aβ42刺激下PC12细胞中MKP1蛋白水平,Aβ42刺激下敲除MKP1和过表达MKP1的PC12细胞中ROS、SOD、MDA、p-JNK、TNF-α、IL-1βm RNA、LDH、Caspase 3及细胞损伤水平,JNK特异性抑制剂SP600125作用下敲除MKP1的PC12细胞中ROS、SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、LDH及细胞损伤水平对Aβ激活MAPK途径的具体分子机制进行初步论述,期待可为靶向作用于MAPK的AD治疗药物的研发提供有力的帮助。方法:实验对象选取野生型PC12细胞、过表达MKP1和稳定敲除MKP1的PC12细胞。为检测Aβ42(Sigma-Aldrich,MO,USA)对PC12细胞活性的影响,在细胞培养基中加入不同浓度的Aβ42(0μM,0.1μM,1μM,10μM和100μM),处理24 h后CCK-8检测细胞活性。为检测Aβ对PC12细胞中MKP1的表达,向细胞培养基中加入10μM的Aβ42,在不同时间点(0 h,6 h,12 h,18 h和24 h)通过q RT-PCR和Western blot检测MKP1表达。为检测MKP1对Aβ所致神经毒性的影响,将野生型PC12细胞分为对照组(Control)和Aβ42组,敲除MKP1的细胞为Aβ42+MKP1 KD组,过表达MKP1细胞为Aβ42+MKP1组,后3组加入10μM Aβ42,置于培养箱中24 h,进行CCK-8等检测。为检测JNK信号途径在MKP1敲除所致神经损伤加重效应中的作用,将MKP1 KD细胞分为Control和SP600125组,给予10μM Aβ42,SP600125组再加入JNK特异性抑制剂SP600125(Sigma-Aldrich)2μM,置于培养箱中24 h,进行CCK-8等检测。使用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行数据处理。结果:在本研究结果中,我们发现经Aβ刺激后,PC12细胞活性受到抑制,MAPK的重要调节因子MKP1表达下调,并呈时间依赖性。过表达MKP1后,Aβ诱导的PC12细胞中p-JNK水平降低,细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平下降,细胞死亡和凋亡减轻,TNF-α和IL-1β表达减少。而敲除MKP1可加重Aβ诱导的PC12细胞氧化应激、炎症反应和细胞损伤。进一步研究发现,JNK抑制剂SP600125可抵消MKP1敲除对Aβ神经毒性的加重效应。结论:本研究表明,Aβ通过下调MKP1表达激活MAPK信号途径,过表达MKP1可通过抑制JNK信号途径减轻Aβ所诱导的细胞凋亡和神经炎症从而发挥神经保护作用。
【关键词】：β淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1 丝裂原活化蛋白激酶 氧化应激
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文缩略词12-13
• 第1章 绪论13-15
• 第2章 综述15-23
• 2.1 氧化应激的概念15
• 2.2 氧化应激相关的物质15-16
• 2.2.1 体内的主要氧化剂15-16
• 2.2.2 抑制自由基生成的物质16
• 2.3 氧化应激与神经细胞的凋亡16-18
• 2.3.1 细胞凋亡的线粒体途径17
• 2.3.2 细胞凋亡的内质网途径17-18
• 2.3.3 细胞凋亡的死亡受体途径18
• 2.4 氧化应激与脑缺血18-20
• 2.4.1 内皮细胞损伤18-19
• 2.4.2 动脉不稳定斑块形成19-20
• 2.4.3 缺血性级联反应，组织细胞再灌注20
• 2.5 氧化应激与神经系统变性疾病20-22
• 2.5.1 氧化应激与阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)20-21
• 2.5.2 氧化应激与帕金森病21-22
• 2.6 问题与展望22-23
• 第3章 材料与方法23-31
• 3.1 细胞培养与处理23
• 3.2 CCK-8 检测23-24
• 3.3 q RT-PCR24-26
• 3.3.1 RNA的提取24
• 3.3.2 RNA浓度测定24-25
• 3.3.3 RNA电泳25
• 3.3.4 RNA逆转录25-26
• 3.3.5 q PCR检测26
• 3.4 Western blot检测26-28
• 3.4.1 细胞中总蛋白提取26-27
• 3.4.2 BCA法测蛋白浓度27
• 3.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳27-28
• 3.5 DCFH-DA检测28
• 3.6 SOD活性和MDA水平检测28
• 3.7 流式细胞术检测28-29
• 3.7.1 预处理28
• 3.7.2 细胞制备28-29
• 3.7.3 流式细胞仪分析29
• 3.8 LDH活性检测29
• 3.9 酶联免疫吸附试验（ELISA）29-30
• 3.10 TUNEL染色30
• 3.11 统计学分析30-31
• 第4章 结果31-37
• 4.1 Aβ_(42)下调PC12细胞中MKP1的表达31-32
• 4.2 MKP1调控Aβ_(42)所致的氧化应激反应32-33
• 4.3 MKP1调控Aβ_(42)所致的神经炎症33-34
• 4.4 MKP1减轻Aβ_(42)所致的神经细胞损伤34-35
• 4.5 抑制JNK减轻MKP1敲除对Aβ_(42)所致神经毒性的效应35-37
• 第5章 讨论37-39
• 第6章 结论39-40
• 参考文献40-47
• 作者简介及科研成果47-48
• 致谢48

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1 李其禄;;9例精神、神经病患者呕吐物中淀粉样蛋白的测定[J];中国民间疗法;2007年07期

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本文编号：711892