染料木素通过JNK调控Fas和Bcl-2家族抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡的机制研究

发布时间：2017-08-22 21:37

  本文关键词：染料木素通过JNK调控Fas和Bcl-2家族抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡的机制研究

  更多相关文章： 染料木素 阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 JNK Fas Bcl-2

【摘要】：染料木素(genistein,Gen)是大豆异黄酮的主要活性成份。Gen作为植物雌激素,与雌激素相比,在发挥神经保护作用的同时没有对非神经细胞的致癌等副作用。Gen的神经保护作用受到持续关注。我们前期的研究发现,Gen可增强PKC的活性,调节α-/β-分泌酶活性,减少不溶性Aβ沉积,并逆转Aβ诱导的Bcl-2的下调和Bax的上调,降低细胞的凋亡程度,最终显著提高Aβ刺激的PC12细胞的活力。目前,有关Gen的神经保护效应及其机制逐渐深入,但其分子保护机制及其相关的信号仍有待进一步阐明。本论文继续探讨Gen体外水平的抗Aβ神经保护机制及其分子机制。具体内容如下:1.Gen对Aβ诱导PC12细胞损伤的细胞活力、凋亡染色、凋亡率的研究:MTT细胞活力测定结果显示,0-25μM的Gen对细胞活力几无影响,而50和100μM Gen使细胞存活率显著降低,Aβ显著降低PC12细胞存活率的最小剂量是20μM,0-100μM的Gen都显著提高Aβ处理的PC12细胞存活率,而25μM的Gen具有最大保护效应;Hoechst 33342凋亡染色结果表明,与对照组相比,Aβ诱导的PC12细胞有明显的凋亡细胞特征,其凋亡细胞比例显著多于对照组,而Gen处理组(12.5、25、50和100μM)显著减少凋亡细胞的比例;Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率结果显示,Aβ组显著高于对照组,且Gen作用组(12.5、25、50和100μM)都显著抑制Aβ诱导的细胞凋亡,但25μM剂量的Gen具有最大抑制效应。2.q PCR和Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表达的影响:q PCR结果显示,Aβ诱导组显著增加Fas L的表达,温和上调Fas的表达,Gen显著抑制Aβ诱导的Fas和Fas L m RNA的增加;Westernblot结果显示,Aβ组显著增加Fas和Fas L的表达,Gen显著抑制Aβ诱导的Fas和Fas L蛋白水平的增加。3.q PCR和Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表达的影响:q PCR结果显示,Aβ组显著减少Bcl-w和增加Bim的表达,Gen可逆转Aβ诱导的Bcl-w和Bim的变化;Western blot结果与q PCR结果一致。4.Western blot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞质中Cyt C和Smac蛋白表达的影响:结果显示,Gen可逆转Aβ刺激引起Cyt C和Smac从线粒体到细胞质的释放。5.q PCR和分光光度法检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力的影响:结果显示,Gen可抑制Aβ诱导Caspase-3和Caspase-8 m RNA的增加;Caspase-3和Caspase-8酶活性测定进一步证实了Gen对Aβ诱导细胞Caspase-3和Caspase-8的抑制作用。6.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Aβ诱导PC12细胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表达的变化:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Fas和Fas L m RNA和蛋白水平表达有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。7.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Aβ诱导PC12细胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表达的变化:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Bcl-w和Bim m RNA和蛋白水平表达有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。8.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Aβ诱导PC12细胞质中Cyt C和Smac蛋白表达的变化:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Cyt C和Smac蛋白表达有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。9.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制剂SP600125干扰JNK,检测Gen对Aβ诱导PC12细胞Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力的影响:结果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起的Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力有抑制作用,Gen与JNK-si RNA/SP600125合用效果最强。10.Westernblot检测Gen对Aβ诱导PC12细胞p-JNK和JNK蛋白表达的影响:结果表明,Aβ显著诱导PC12细胞p-JNK 54和46 k Da条带,而Gen可显著减弱p-JNK 54和46 k Da条带,Gen+SP600125合用效果最强。研究结果表明,JNK-si RNA和SP600125均对Aβ刺激引起Fas介导凋亡途径和线粒体凋亡途径有抑制作用,暗示JNK参与调节Aβ诱导PC12细胞Fas介导的和线粒体起始的凋亡途径,而Gen显著抑制Aβ诱导的JNK磷酸化的结果表明,Gen可能通过对Aβ诱导的JNK依赖的Fas和线粒体凋亡通路的抑制,从而抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡,发挥神经保护作用。然而,Gen与JNK-si RNA或JNK抑制剂SP600125合用组的结果表明,Gen针对Aβ诱导的Fas和线粒体凋亡通路的抗凋亡效应可能只是Gen多靶点抗凋亡效应的其中之一,其神经保护机制有待进一步被阐明。
【关键词】：染料木素 阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 JNK Fas Bcl-2
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-20
• 一、AD及研究策略概况12-16
• 1 AD以及分子病理机制概述12-14
• 1.1 中枢胆碱能损伤12
• 1.2 微管相关蛋白-Tau蛋白异常学说12-13
• 1.3 Aa级联学说13
• 1.4 基因突变或多型性学说13-14
• 1.5 免疫功能突变14
• 1.6 兴奋性氨基酸毒性学说14
• 2 针对AD的研究策略14-16
• 2.1 药物治疗15
• 2.2 中医中药15
• 2.3 神经干细胞移植治疗15
• 2.4 基因治疗15
• 2.5 其它干预治疗15-16
• 二、凋亡与AD16
• 1 Aa与神经细胞凋亡16
• 2 PS突变与神经细胞凋亡16
• 3 Ca_(2+)失衡与神经细胞凋亡16
• 三、GEN神经保护作用研究概况16-18
• 1 直接与Aβ 结合17
• 2 抗氧化作用17
• 3 抑制Ca_(2+)超载及兴奋性毒性损伤17-18
• 4 抑制炎症反应18
• 5 激活受体18
• 四、本研究的目的和意义18-20
• 第一部分 染料木素抑制AΒ诱导PC12细胞凋亡的研究20-29
• 一、材料与方法20-24
• 1 实验材料20-22
• 1.1 主要试剂20
• 1.2 实验细胞20
• 1.3 主要仪器20-21
• 1.4 主要试剂配制21-22
• 2 实验方法22-24
• 2.1 PC12细胞培养22-23
• 2.2 MTT检测细胞活力23
• 2.3 Hoechst33342染色法观察细胞形态变化23
• 2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率23
• 2.5 统计学处理23-24
• 二、结果24-27
• 1 Gen对Aβ 诱导PC12细胞损伤的细胞活力影响24-25
• 2 Hoechst 33342染色观察Gen对Aβ 诱导PC12细胞凋亡的形态影响25-26
• 3 Annexin V-FITC流式细胞仪检测Gen对Aβ 诱导PC12细胞凋亡率的影响26-27
• 三、讨论27-29
• 第二部分 染料木素抑制AΒ诱导PC12细胞凋亡的研究29-49
• 一、材料与方法30-43
• 1 实验材料30-33
• 1.1 主要试剂30-31
• 1.2 实验细胞31
• 1.3 主要仪器31-32
• 1.4 主要试剂配制32-33
• 2 实验方法33-43
• 2.1 PC12细胞培养33
• 2.2 RT-q PCR分析33-37
• 2.3 免疫印迹分析37-41
• 2.4 Caspase-3 和Caspase-8 酶活力检测41-43
• 2.5 统计学处理43
• 二、结果43-46
• 1 Gen对Aβ 诱导PC12细胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表达的影响43-44
• 2 Gen对Aβ 诱导PC12细胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表达的影响44-45
• 3 Gen对Aβ 诱导PC12细胞Cyt C和Smac蛋白表达的影响45-46
• 4 Gen对Aβ 诱导PC12细胞Caspase-3 和Caspase-8 m RNA和酶活力的影响46
• 三、讨论46-49
• 第三部分 JNK信号在染料木素对AΒ诱导PC12细胞凋亡抑制的作用研究49-57
• 一、材料与方法50-51
• 1 实验材料50
• 1.1 主要试剂50
• 1.2 实验细胞50
• 1.3 主要仪器50
• 1.4 主要试剂配制50
• 2 实验方法50-51
• 2.1 PC12细胞培养50
• 2.2 RNA干扰50-51
• 2.3 RT-q PCR分析51
• 2.4 免疫印迹分析51
• 2.5 Caspase-3 和Caspase-8 酶活力检测51
• 2.6 统计学处理51
• 二、结果51-55
• 1 JNK-si RNA和SP600125对Gen调节的Aβ 诱导PC12细胞Fas和Fas Lm RNA和蛋白表达的影响51-52
• 2 JNK-si RNA和SP600125对Gen调节的Aβ 诱导PC12细胞Bcl-w和Bimm RNA和蛋白表达的影响52-53
• 3 JNK-si RNA和SP600125对Gen调节的Aβ 诱导PC12细胞Cyt C和Smac蛋白表达的影响53-54
• 4 JNK-si RNA和SP600125对Gen调节的Aβ 诱导PC12细胞Caspase-3 和Caspase-8 m RNA表达和酶活力的影响54-55
• 5 Gen对Aβ 诱导PC12细胞JNK磷酸化水平的影响55
• 三、讨论55-57
• 总结57-60
• 参考文献60-68
• 主要英文缩写词表68-70
• 攻读硕士期间发表的论文70-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 张洁;闫福岭;管学能;;Egb761对脑慢性低灌注老龄大鼠海马β-分泌酶活性的影响[J];中国临床神经科学;2006年05期

2 张均田;老年痴呆的发病机理及治疗策略[J];药学学报;2000年08期

3 胡昔权,钱采韵,窦祖林,钟思陶,林宏川;Alzheimer病与老年脑中β-淀粉样蛋白免疫组化的研究[J];中国神经精神疾病杂志;1998年01期

4 赵美顺;陈敬荣;郑尧杰;杨红;;染料木素对Aβ诱导损伤的PC12细胞的保护作用[J];中国药科大学学报;2014年02期

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本文编号：721102