化学交联Aβ的神经毒性及与胰岛素受体相互作用研究

发布时间：2017-08-27 00:24

  本文关键词：化学交联Aβ的神经毒性及与胰岛素受体相互作用研究

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【摘要】：淀粉样蛋白β(Amyloid β,Aβ)是阿尔茨海默症的重要特征分子之一,同时也被认为是该病的主要风险因子。Aβ单体能够进行自我聚集形成分子量各异的多种聚集体,并通过多种方式损伤神经系统,其中寡聚体Ap与重要信号通路的受体相互作用被认为是其发挥神经毒性的核心方式。化学交联方法是Ap研究中用于制备寡聚体Aβ的主要手段,但化学交联过程是否对Aβ聚集体的性质和神经毒性产生影响尚未得到明确的阐释；。本论文以传统的非交联方法制备的Aβ寡聚体为对照,对非修饰蛋白的光催化交联法(photo-induced cross-linking of unmodified proteins, PICUP)和Cu2+氧化交联法制备的Aβ聚集体的性质和神经毒性进行了研究；另外,已有研究报道不同的Aβ寡聚体具有不同的神经毒性,而对于不同的Aβ寡聚体是否通过不同的途径产生不同的病理作用还没有明确的报道,本论文以神经元胰岛素受体(insulin receptor, IR)为研究对象,研究了PICUP法制备的不同的寡聚体对胰岛素受体分布的影响。研究结果如下 1),通过控制PICUP和Cu2+氧化交联的反应条件,获得了两种不同方法制备的一定分子量范围的Aβ聚集体,并通过透析方法除去了溶液中的交联剂。通过tricine-SDS-PAGE检测发现,不同制备方法获得的Ap中,Ap单体所占总体比例存在明显差异,不同分子量大小的Ap寡聚体所占比例略有不同,其中PICUP法制备Ap聚集体的效率最高,非交联法获得Ap聚集体的量最低；Zeta电位检测发现,三种Ap溶液的Zeta电位均处于-10-15mV区间,属于具有进一步聚集趋势的非稳定状态。硫磺素T检测表明,Cu2+氧化交联Aβ具有远低于非交联Aβ和PICUP-Aβ的β-片层结构密度,显示其可能具有不同于其他两者的神经毒性。 2)本论文使用上述3种Ap对新生SD大鼠海马神经元进行了浓度梯度处理,通过MTT检测、流式细胞术以及Western印迹法对神经元存活率、不同时期凋亡率以及关键凋亡蛋白的活化程度的检测,比较了不同方法制备的Ap的神经毒性。结果表明在三种Ap中,Cu2+氧化交联Ap降低神经元存活率的能力最强,能够最高程度地诱导神经元进入早期／中晚期凋亡,引起了凋亡蛋白Caspase3活化程度的显著上调,并且导致细胞浆中细胞色素c含量升高。然而,在Cu2+氧化交联Aβ引起Caspase9活化的过程中,可能存在对Caspase9上游信号的调控而最终体现为和另外两种Aβ相似的Caspase9活性。此外,三种Aβ都具有引起T-NOS和CAT酶活上调的能力,其中Cu2+/H2O2交联Aβ较强的CAT活力上调功能表明该交联Aβ具有更复杂的毒性机理。 3)利用电洗脱回收和有机溶剂沉淀法,成功分离和富集了2-4聚体Aβ,分别使用不同寡聚态的Aβ进行了神经元处理,并观测了神经元R受到的影响。细胞免疫荧光试验结果表明：二聚体Aβ主要具有诱导IR重新分布的作用,而三聚体和四聚体更倾向于竞争性结合IR并引起IR密度降低。
【关键词】：淀粉样蛋白β 化学交联 神经毒性 胰岛素受体
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-11
• 引言11-12
• 1 文献综述12-30
• 1.1 阿尔茨海默症及其致病学说12-13
• 1.1.1 阿尔茨海默症及其危害12
• 1.1.2 Aβ致病学说12-13
• 1.2 oAβ的形成及毒性机理13-28
• 1.2.1 Aβ的产生和oAβ的形成13-15
• 1.2.2 oAβ的毒性机理15-17
• 1.2.3 oAβ的修饰和制备17-19
• 1.2.4 oAβ的主要相互作用蛋白19-27
• 1.2.5 oAβ-IR相互作用对IR信号通路的影响27-28
• 1.3 本论文的研究目标及内容28-30
• 2 化学交联方法制备Aβ30-43
• 2.1 引言30
• 2.2 仪器与试剂30-31
• 2.2.1 实验仪器30-31
• 2.2.2 实验试剂31
• 2.3 实验方法31-35
• 2.3.1 Aβ_(1-40)粉末的预处理31
• 2.3.2 Aβ的制备31-33
• 2.3.3 对Aβ聚集度的检测33-35
• 2.4 结果与讨论35-41
• 2.4.1 Aβ聚集情况35-37
• 2.4.2 Aβ结构检测37-40
• 2.4.3 不同Aβ的Zeta电位检测40-41
• 2.4.4 化学交联Aβ中金属离子的测定41
• 2.5 小结41-43
• 3 化学交联对Aβ神经毒性的影响43-60
• 3.1 引言43
• 3.2 仪器与试剂43-44
• 3.2.1 实验仪器43-44
• 3.2.2 实验试剂44
• 3.3 实验方法44-49
• 3.3.1 SD大鼠海马神经元原代培养44-45
• 3.3.2 MTT法测定细胞存活率45-46
• 3.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡率46-47
• 3.3.4 凋亡蛋白Caspase 3/9激活检测47
• 3.3.5 Western blotting47-48
• 3.3.6 总一氧化氮合酶的测定48
• 3.3.7 过氧化氢酶的测定48-49
• 3.4 结果与讨论49-58
• 3.4.1 MTT法测定Aβ处理后的神经元存活率49-52
• 3.4.2 流式细胞术检测Aβ引发的神经元凋亡52-54
• 3.4.3 神经元接受Aβ处理后的Caspase 3/9活化量检测54-55
• 3.4.4 Western印迹法检测Ap处理后细胞色素c的含量55-56
• 3.4.5 Aβ处理神经元后T-NOS活力的测定56-57
• 3.4.6 Aβ处理神经元后对过氧化氢酶的测定57-58
• 3.5 小结58-60
• 4. 不同寡聚态Aβ-IR相互作用研究60-67
• 4.1 引言60
• 4.2 仪器与试剂60-61
• 4.2.1 实验仪器60-61
• 4.2.2 实验试剂61
• 4.3 实验方法61-63
• 4.3.1 电洗脱法分离不同寡聚态oAβ61-62
• 4.3.2 细胞免疫荧光62-63
• 4.4 结果与讨论63-66
• 4.4.1 电洗脱沉淀回收oAβ条件的优化63-65
• 4.4.2 不同寡聚态Aβ对神经元IR的影响65-66
• 4.5 小结66-67
• 结论67-68
• 参考文献68-72
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况72-73
• 致谢73-74

【共引文献】

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本文编号：743485