长链非编码RNA在吗啡成瘾及心肌缺血再灌注损伤中作用的初步探究

发布时间：2017-09-01 10:32

  本文关键词：长链非编码RNA在吗啡成瘾及心肌缺血再灌注损伤中作用的初步探究

  更多相关文章： 吗啡 成瘾 免疫抑制 长链非编码RNA 脑前额叶皮层 神经小胶质细胞 心肌缺血再灌注损伤 缺氧再复氧损伤 长链非编码RNA 细胞凋亡 细胞自噬 造血干细胞 约束应激 免疫抑制 坏死 凋亡

【摘要】：研究背景和研究意义吗啡是阿片中主要的生物碱,有强烈的麻醉、镇痛作用,是目前治疗疼痛最有效的化合物之一,其用于疼痛治疗已有数百年的历史,然而它的使用有很多限制,如：产生依赖性、耐受性、痛觉过敏、精神朦胧及免疫调节,而且毒品滥用也是威胁人类生存的重大社会问题。因此对其分子机制的研究有助于找到有效的预防和治疗方法。药物成瘾有着极其复杂的机制,国内外数十年来对其机制的研究多从行为学、受体、神经递质、蛋白差异表达等方面进行研究。但是从ncRNA方面,尤其是长链非编码RNA (Long non-coding RNA, lncRNA)参与调控吗啡成瘾的研究却鲜见报道。我们从一个新颖的角度来研究吗啡依赖性等副作用的分子机制,即lncRNA是如何参与调控吗啡副作用的。lncRNA是一类长度大于200nt的RNA,本身不编码蛋白质,而是以RNA的形式在多个层面上(表观遗传、转录、转录后水平)调控基因的表达。近年来的研究表明：lncRNA广泛参与各种生物学过程,其异常表达与多种疾病密切相关。lncRNA逐渐成为疾病治疗所靶向的新分子。我们所用的动物模型是吗啡成瘾的C57 BL/6小鼠,选用的实验材料是大脑脑前额叶皮层(Prefrontal cortex, PFC),因为前额叶皮层作为大脑的高级中枢,是脑中对吗啡最敏感的部位之一,在药物成瘾过程中发挥重要作用。神经解剖学显示PFC存在密集的μ阿片受体。PFC能够调控成瘾相关的行为和认知变化。神经小胶质细胞(Microglia, MG)是中枢神经系统中最小的一种胶质细胞,是机体神经系统的免疫细胞,可保护大脑免于损伤及大脑疾病再生。MG在神经元的生理活动中起着营养、支持、保护等重要功能,是CNS中的第一道也是最主要的一道免疫防线。MG常被用作研究吗啡成瘾的重要的体外模型。我们在建立了吗啡成瘾小鼠模型后,提取了小鼠脑前额叶皮层总RNA,质检成功后进行lncRNA表达谱芯片的检测,并对其进行qRT-PCR验证。与此同时,我们用吗啡处理MG后进行细胞水平的验证。本研究的意义是：从lncRNA的角度来研究吗啡副作用,为研究阿片类物质依赖性、成瘾性及免疫抑制机制提供了新的思路,扩展和丰富了成瘾相关的分子调控网络； 为预防与治疗成瘾性疾病提供理论依据和新的治疗靶标；为lncRNA作为临床戒毒药物靶点提供新的应用前景。研究结果1. lncRNA表达谱芯片检测筛选出脑前额叶皮层中493个上调的lncRNA和255个下调的lncRNA为了找出参与吗啡副作用形成的lncRNA,我们建立了吗啡成瘾的小鼠模型,解剖成瘾小鼠,冰上快速分离出PFC,提取组织RNA后送到芯片公司进行lncRNA表达谱芯片的检测,其中上调的和下调的lncRNA数目分别是493个和255(变化倍数≥1.5,P ≤ 0.05)。2. qRT-PCR结果显示5种lncRNA在脑前额叶皮层中差异表达我们进一步从芯片结果中挑选出10个变化倍数最大(6),P值最小(0.01)的lncRNA进行qRT-PCR验证。在脑组织中验证出5个lncRNA与芯片结果相符(AK157323、AK007908、AK160450、AK018061和AK140599),其中显著上调的为AK157323和AK140599,显著下调的为AK007908、AK160450和AK018061,可进行下一步研究。结论我们通过提取总RNA,并对lncRNA表达谱进行芯片分析,结合qRT-PCR验证,最终确定AK157323、AK007908、AK160450、AK018061及AK140599在吗啡成瘾小鼠的PFC区,具有显著的变化趋势,很有可能参与吗啡引起的依赖性、免疫抑制或细胞凋亡等过程,将为进一步的分子机制研究奠定坚实的基础。研究背景和研究意义心脏疾病是威胁人类健康的头号杀手。对于治疗心肌梗死(myocardial infarction, MI),冠脉再灌注这—治疗方法能抑制心力衰竭的发生并降低死亡率。虽然这一方法十分有效,但是这个过程本身也会引起心肌损伤和病理性心肌重构,这种损伤被称为“心肌缺血再灌注(Ischemia and Reperfusion, I/R)损伤”。其中,最显著的表现就是不可逆的细胞死亡。研究者们进行体外研究时,通常采用的体外模型是对心肌细胞进行缺氧再复氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)处理,以模拟体内I/R的过程,即先进行去血清低葡萄糖并缺氧处理,再进行恢复血清和葡萄糖并复氧处理。H/R诱导的损伤性的细胞凋亡和破坏性的细胞自噬,是心肌梗死所引起组织损伤的重要病理因素。因此,探究H/R损伤的分子机制或许能为治疗心肌缺血再灌注损伤提供潜在的靶标。心脏基因调控网络的异常调节与心脏疾病的发生有着密切联系,而许多研究表明lncRNA在包括心血管疾病在内的众多人类疾病中起作用。我们建立了心肌缺血再灌注损伤的体外研究模型,提取细胞总RNA后进行lncRNA高通量测序,并进行了相关生物信息学的分析。本研究从lncRNA的角度探究心肌缺血再灌注损伤的分子机制,为缺血性心脏疾病的治疗提供新的理论基础和分子靶标。研究结果1.缺氧再复氧诱导H9c2心肌细胞发生凋亡对H9c2心肌细胞进行H/R处理之后,从细胞形态上看,部分细胞变圆漂浮起来已经死亡。从Western Blot的结果看,H/R能够显著诱导心肌细胞凋亡。流式细胞术的结果又进一步验证了这个结论,同时,细胞坏死也是增加的。2.缺氧再复氧诱导H9c2心肌细胞发生自噬Western Blot结果显示,细胞进行H/R处理之后,细胞的自噬水平显著增加。3.高通量测序结果高通量测序检测出46个表达差异显著的mRNA转录本、2个表达差异显著的已知lncRNA转录本、1029个表达差异显著的新lncRNA转录本及100个表达差异显著的基因。结论缺氧再复氧能够显著诱导心肌细胞凋亡和自噬。说明我们的体外模型建立得比较成功和顺利。在后续的研究中,我们将基于高通量测序的检测结果结合lncRNA靶基因预测、IncRNA-miRNA互作、KEGG生物通路富集分析、GO基因功能富集分析等生物信息学分析,进行分子机制的深入研究。研究背景和研究目的干细胞是具有自我更新能力和分化潜能的一类细胞,能够增殖并产生高度分化的功能细胞。近年来兴起了干细胞移植治疗这一先进的医学技术。造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells, HSCs)是成体中研究最为广泛的的干细胞之一,并且是已被证明具有临床应用价值的干细胞类型。HSC为多潜能成体干细胞,能分化为所有成熟的血细胞。应激会导致机体损伤,其中慢性应激会对免疫系统产生较大影响,引起癌症、免疫失调等众多疾病。约束应激能够上调糖皮质激素的水平,诱导脾脏、胸腺及外周血中淋巴细胞凋亡。已有报道表明,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)能够抑制约束应激引起的脾淋巴细胞的凋亡。而HSC是所有造血细胞和免疫细胞的起源,相对于MSC而言在功能上专一性更强。本研究的目的在于探究HSC是否也对约束应激所引起的免疫抑制起作用,甚至有更强的作用。我们的体内实验是通过建立约束应激的Balb/C小鼠模型进行探究的。相应的体外研究是用人工合成的糖皮质类固醇激素地塞米松处理脾淋巴细胞建立体外模型。我们从供体小鼠骨髓中用磁珠分选法提取HSC,用CFDASE处理进行绿色荧光标记后,尾静脉注射到受体小鼠的体内。对受体小鼠建立约束应激模型,解剖小鼠,检测绿色荧光细胞在受体小鼠的脾脏和骨髓中的分布情况。体外实验则是将提取的HSC与正常脾脏细胞共培养,并用地塞米松处理细胞,流式细胞术检测细胞的凋亡和坏死情况。实验结果1.约束应激3天起,脾脏和骨髓中出现绿色荧光标记的HSC细胞注射有绿色荧光标记的HSC的受体小鼠约束应激2天后,脾脏和骨髓中尚未出现HSC；3天后脾脏和骨髓中已出现HSC；4天后脾脏和骨髓中HSC更多。2.在体外HSC抑制脾脏细胞的坏死而非凋亡体外实验显示,糖皮质激素地塞米松诱导脾脏细胞坏死和凋亡。而加入HSC共培养后,脾脏细胞的坏死率降低,凋亡率升高。结论1.约束应激第三天,绿色荧光标记的HSC出现于受体小鼠脾脏和骨髓中,推测HSC可能在损伤部位起修复作用。2.HSC抑制地塞米松诱导的脾脏细胞坏死而促进地塞米松诱导的细胞凋亡。
【关键词】：吗啡 成瘾 免疫抑制 长链非编码RNA 脑前额叶皮层 神经小胶质细胞 心肌缺血再灌注损伤 缺氧再复氧损伤 长链非编码RNA 细胞凋亡 细胞自噬 造血干细胞 约束应激 免疫抑制 坏死 凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.6
【目录】：

• 第一部分 长链非编码RNA参与吗啡成瘾的初步探究7-45
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 缩略词表12-13
• 前言13-23
• 1. 吗啡13-15
• 1.1 阿片类药物13
• 1.2 吗啡及其副作用13-15
• 2. lncRNA15-21
• 2.1 lncRNA的特点15-16
• 2.2 lncRNA的分类16
• 2.3 lncRNA的宏观作用机制16-18
• 2.4 lncRNA的生物学功能18
• 2.5 lncRNA与生理病理18
• 2.6 lncRNA与药物成瘾18-20
• 2.7 lncRNA的研究技术和主要工具20-21
• 3. 脑前额叶皮层和神经小胶质细胞21-23
• 实验材料与方法23-35
• 1. 实验材料23
• 2. 试剂和耗材23-24
• 3. 仪器设备24
• 4. 主要溶液及试剂配方24-26
• 4.1 BV2细胞培养用试剂24-25
• 4.2 核酸电泳用试剂25-26
• 4.3 DEPC水的配制26
• 5. 实验方法26-35
• 5.1 小鼠的饲养与管理26
• 5.2 吗啡成瘾模型的建立26-27
• 5.3 小鼠的脑部解剖及脑前额叶皮层的提取27-28
• 5.4 RNA的提取28-29
• 5.5 PCR实验29-30
• 5.6 细胞培养30-32
• 5.7 lncRNA芯片32
• 5.8 统计学分析32-35
• 实验结果35-37
• 1. 吗啡依赖的小鼠体重减轻35
• 2. 提取的吗啡成瘾小鼠脑前额叶皮层总RNA的质量符合后续实验要求35
• 3. lncRNA芯片检测结果35
• 4. 利用qRT-PCR法对脑前额叶皮层进行芯片结果的验证35
• 5. 吗啡处理BV2细胞后提取的总RNA质量符合后续实验要求35-36
• 6. BV2细胞系中qRT-PCR法对芯片结果的验证36-37
• 讨论37-39
• 附图39-45
• 第二部分 长链非编码RNA参与心肌缺血再灌注损伤的体外研究45-77
• 中文摘要45-47
• ABSTRACT47-49
• 缩略词表49-51
• 前言51-53
• 实验材料与方法53-63
• 1. 实验材料53
• 2. 试剂和耗材53
• 3. 仪器设备53-54
• 4. 主要溶液及试剂配方54-57
• 4.1 H9c2细胞培养用试剂54
• 4.2 SDS-PAGE用试剂54-55
• 4.3 转膜用试剂55-57
• 5. 实验方法57-63
• 5.1 心肌缺血再灌注体外模型的建立57
• 5.2 Western Blot实验57-60
• 5.3 lncRNA高通量测序60-63
• 实验结果63-65
• 1. 缺氧再复氧后,细胞死亡增加63
• 2. 缺氧再复氧诱导细胞凋亡63
• 3. 缺氧再复氧明显诱导细胞自噬63
• 4. 在缺氧处理8h时β-arrestin2和TLR-9蛋白表达水平较其它时间点变化大63
• 5. 高通量测序检测出46个表达差异显著的mRNA转录本63
• 6. 高通量测序检测出2个表达差异显著的已知lncRNA转录本63
• 7. 高通量测序检测出1029个表达差异显著的新lncRNA转录本63-64
• 8. 高通量测序检测出100个表达差异显著的基因及差异基因的KEGG生物通路富集分析和GO基因功能富集分析结果64-65
• 讨论65-67
• 附图67-77
• 第三部分 骨髓造血干细胞在约束应激引起的免疫抑制中的作用77-101
• 中文摘要77-79
• ABSTRACT79-81
• 缩略词表81-83
• 前言83-85
• 实验材料与方法85-93
• 1. 实验材料85
• 2. 试剂和耗材85
• 3. 仪器设备85
• 4. 主要溶液及试剂配方85-86
• 4.1 造血干细胞和脾脏细胞提取过程中所需试剂85-86
• 4.2 脾脏细胞培养用试剂86
• 4.3 地塞米松储存液86
• 4.4 PI单染实验用试剂86
• 5. 实验方法86-93
• 5.1 CD34+造血干细胞的提取87-88
• 5.2 小鼠脾脏细胞的提取88
• 5.3 CD34+造血干细胞的体内示踪实验88-89
• 5.4 小鼠慢性约束应激模型的建立89
• 5.5 脾脏细胞在体外与CD34+造血干细胞共培养89
• 5.6 流式细胞术实验89-93
• 实验结果93-95
• 1. 约束应激3天,脾脏和骨髓中出现HSC细胞93
• 2. 在体外HSC抑制脾脏细胞的坏死而非凋亡93-95
• 讨论95-97
• 附图97-101
• 参考文献101-107
• 致谢107-109
• 攻读学位期间发表的论文109-110
• 学位论文评阅及答辩情况表110

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